Univerzalni SYBR GREEN qPCR premiks (plavi)
Kataloški broj: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (bazirana na boji) je prethodno rješenje za 2× kvantitativnu PCR amplifikaciju u realnom vremenu koju karakterizira visoka osjetljivost i specifičnost, plave je boje i ima efekat praćenja dodavanja uzorka.Osnovna komponenta Taq DNK polimeraze koristi antitelo sa vrućim startom da efikasno inhibira nespecifično amplifikaciju usled žarenja prajmera tokom pripreme uzorka.U isto vrijeme, formula dodaje promotivne faktore za poboljšanje efikasnosti amplifikacije PCR reakcije i izjednačavanje amplifikacije gena sa različitim sadržajem GC (30 ~ 70%), tako da kvantitativni PCR može dobiti dobar linearni odnos u širokom kvantitativnom region.Ovaj proizvod sadrži specijalnu ROX pasivnu referentnu boju, koja je primjenjiva na većinu qPCR instrumenata.Nije potrebno podešavati koncentraciju ROX-a na različitim instrumentima.Potrebno je samo dodati prajmere i šablone kako bi se reakcioni sistem pripremio za amplifikaciju.
Komponente
Universal Blue qPCR Master Mix
Uslovi skladištenja
Proizvod se isporučuje sa paketima leda i može se čuvati na -25℃~-15℃ 18 meseci.Prilikom skladištenja ili pripreme reakcionog sistema potrebno je izbegavati jako zračenje svetlosti.
Specifikacija
| Koncentracija | 2× |
| Metoda detekcije | SYBR |
| PCR metoda | qPCR |
| Polimeraza | Taq DNK polimeraza |
| Vrsta uzorka | DNK |
| Oprema za primenu | Većina qPCR instrumenata |
| Vrsta proizvoda | SYBR premiks za kvantitativni PCR fluorescencije u realnom vremenu |
| Prijavite se na (prijava) | Gene Expression |
Instrukcije
1.Reaction System
| Komponente | Volom (μL) | Volom (μL) | Konačna koncentracija |
| Univerzalni SYBR GREEN qPCR premiks | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| Reverse Primer (10μmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 μmol/L |
| DNK | X | X | |
| ddH2O | do 50 | do 20 | - |
[Napomena]: Temeljno promiješajte prije upotrebe kako biste izbjegli prekomjerne mjehuriće od snažnog mućkanja.
a) Koncentracija prajmera: Konačna koncentracija prajmera je 0,2 μmol/L, a prema potrebi se može podesiti između 0,1 i 1,0 μmol/L.
b) Koncentracija šablona: Ako je šablon nerazrijeđen osnovni rastvor cDNK, upotrijebljena zapremina ne smije prelaziti 1/10 ukupnog volumena qPCR reakcije.
c) Razblaživanje šablona: Preporučuje se da se osnovni rastvor cDNK razblaži 5-10 puta.Optimalna količina dodanog šablona je bolja kada je vrijednost Ct dobivena pojačavanjem 20-30 ciklusa.
d) Reakcioni sistem: Preporučuje se upotreba 20μL ili 50μL kako bi se osigurala efikasnost i ponovljivost amplifikacije ciljnog gena.
e) Priprema sistema: Molimo pripremite se u super čistoj klupi i koristite vrhove i reakcijske epruvete bez ostataka nukleaze;preporučljivo je koristiti vrhove sa filter patronama.Izbjegavajte unakrsnu kontaminaciju i kontaminaciju aerosolom.
2.Reakcioni program
Standardni program
| Korak ciklusa | Temp. | Vrijeme | Ciklusi |
| Početna denaturacija | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denaturacija | 95℃ | 10 sek | 40 |
| Žarenje/produženje | 60℃ | 30 sec★ | |
| Faza krivulje topljenja | Zadane postavke instrumenta | 1 | |
Brzi program
| Korak ciklusa | Temp. | Vrijeme | Ciklusi |
| Početna denaturacija | 95℃ | 30 sec | 1 |
| Denaturacija | 95℃ | 3 sek | 40 |
| Žarenje/produženje | 60℃ | 20 sec★ | |
| Faza krivulje topljenja | Zadane postavke instrumenta | 1 | |
[Napomena]: Brzi program je pogodan za veliku većinu gena, a standardni programi se mogu isprobati za pojedinačne složene gene sekundarne strukture.
a) Temperatura i vrijeme žarenja: Molimo podesite prema dužini prajmera i ciljnog gena.
b) Prikupljanje fluorescentnog signala (★): Postavite eksperimentalni postupak prema zahtjevima u uputama za upotrebu instrumenta.
c) Kriva topljenja: Standardni program instrumenta može se normalno koristiti.
3. Analiza rezultata
Za kvantitativne eksperimente bile su potrebne najmanje tri biološke replike.Nakon reakcije potrebno je potvrditi krivulju amplifikacije i krivulju topljenja.
3.1 Kriva pojačanja:
Standardna kriva pojačanja je u obliku slova S.Kvantitativna analiza je najpreciznija kada vrijednost Ct padne između 20 i 30. Ako je vrijednost Ct manja od 10, potrebno je razrijediti šablon i ponoviti test.Kada je vrednost Ct između 30-35, potrebno je povećati koncentraciju šablona ili zapreminu reakcionog sistema, kako bi se poboljšala efikasnost amplifikacije i obezbedila tačnost analize rezultata.Kada je vrijednost Ct veća od 35, rezultati testa ne mogu kvantitativno analizirati ekspresiju gena, ali se mogu koristiti za kvalitativnu analizu.
3.2 Kriva topljenja:
Pojedinačni vrh krivulje topljenja pokazuje da je specifičnost reakcije dobra i da se može izvršiti kvantitativna analiza;ako kriva topljenja pokazuje dvostruke ili višestruke vrhove, kvantitativna analiza se ne može izvršiti.Kriva topljenja pokazuje dvostruke pikove i potrebno je procijeniti da li je neciljani pik prajmer dimer ili nespecifična amplifikacija elektroforezom DNK agaroznog gela.Ako se radi o dimeru prajmera, preporučuje se smanjenje koncentracije prajmera ili redizajn prajmera sa visokom efikasnošću amplifikacije.Ako je u pitanju nespecifična amplifikacija, povećajte temperaturu žarenja ili redizajnirajte prajmere sa specifičnošću.
Bilješke
Molimo vas da nosite neophodnu OZO, kao što je laboratorijski mantil i rukavice, kako biste osigurali svoje zdravlje i sigurnost!
Ovaj proizvod je SAMO za istraživačku upotrebu!
