Komplet za direktni PCR biljaka

Kataloški broj: HCR2020A

Plant Direct PCR komplet je pogodan za direktno umnožavanje listova biljaka, sjemena, itd., i može se koristiti za visokopropusno ispitivanje biljnih uzoraka koji ne sadrže polisaharide i polifenole.Direktna amplifikacija DNK polimeraze zasnovana na usmjerenoj evoluciji ima superiornu toleranciju na PCR inhibitore u biljkama.U međuvremenu, održava visoke performanse amplifikacije, što je pogodno za amplifikaciju DNK fragmenata unutar 5 kb.Jedinstveni pufer za lizu A u kompletu može se koristiti za lizu svježih ili smrznutih biljnih tkiva.Jednostavan je za rukovanje i lizat se može koristiti kao šablon za amplifikaciju bez prečišćavanja.Sistem sadrži zaštitne agense koji omogućavaju da se sirovi uzorci efikasno pojačaju nakon ponovnog zamrzavanja i odmrzavanja.2 × Plant Direct Master Mix treba samo da doda prajmere i šablone za izvođenje reakcije amplifikacije, čime se smanjuju operacije pipetiranja i poboljšavaju protok detekcije i ponovljivost rezultata.

Komponente

*Plant Direct Lysis Buffer B je opcioni reagens, koji se koristi za neutralizaciju Plant Direct Lysis Buffer A radi produžavanja vremena skladištenja uzoraka.Može se koristiti u skladu sa stvarnom situacijom.

Uslovi skladištenja

2 × Plant Direct Master Mix, čuvajte na -30 ~ -15℃ i izbjegavajte ponovno zamrzavanje i odmrzavanje;Plant Direct Lysis Buffer, čuvajte na -30 ~ -15 ℃ ili 2 ~ 8 ℃.

Proces eksperimentiranja

Obrada uzorka–Plant Leaf

Direktna metoda:Preporučljivo je koristiti mlade listove.Koristite bušilicu za rupe fiksnog prečnika od 0,5 – 3 mm da dobijete mali i ujednačen uzorak, a zatim direktno dodajte uzorak u PCR sistem (preporučuje se sistem od 50 μl).Napomena, provjerite je li uzorak u PCR otopini, a ne na zidu epruvete.Ako se direktni PCR koristi za amplifikaciju dugih fragmenata i složenih uzoraka, korištenje uzorka manjeg promjera (0,5 – 1 mm) kao šablona može pomoći u postizanju boljih rezultata.

Metoda lize mljevenja:Preporučljivo je koristiti mlade listove.Uzmite mali komad lista (oko 1 – 3 mm u prečniku), stavite ga u 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab i sameljite što je više moguće (ovaj korak se može uraditi stiskanjem lista vrhom pipete od 100 μl za gnječenje uzorka).Ako se koriste veće količine lisnog tkiva (ne prelaze 7 mm), povećajte volumen pufera za razrjeđivanje na 50 μl.Nakon što se listovi samelju, otopina bi trebala izgledati zeleno.Nakon kratkog centrifugiranja, dodajte 1 μl supernatanta u PCR sistem kao reakcijsku šablonu.

Metoda termičke lize:Preporučljivo je koristiti mlade listove.Uzmite mali komad lista (oko 1 – 3 mm u prečniku), stavite ga u 20 μl Plant Direct Lysis pufer A i zagrevajte ga na 95°C 5 – 10 min.Vrijeme lize može se na odgovarajući način produžiti za listove koje je teško lizirati (ne više od 20 min).Ako se koriste veće količine lisnog tkiva (ne prelaze 7 mm), povećajte volumen pufera za razrjeđivanje na 50 μl.Nakon zagrijavanja, kratko centrifugirajte i dodajte 1 μl supernatanta u PCR sistem kao reakcijski šablonb.

Obrada uzorka–Sjemenke biljke

Metoda lize mljevenja:Upotrijebite skalpel da izrežite sjemenke promjera 5 mm, dodajte ih u 100 μl Plant Direct Lysis pufera A i izmrvite uzorak vrhom pipete ili drugim alatima.Kratko promešati i ostaviti da odstoji na sobnoj temperaturi 3 – 5 min.Uvjerite se da je uzorak sjemena potopljen u pufer za razrjeđivanje.Nakon kratkog centrifugiranja, dodajte 1 μl supernatanta u PCR sistem kao šablon za reakciju.

Metoda termičke lize:Skalpelom izrežite sjeme promjera 5 mm, dodajte ih u 100 μl Plant Direct Lysis Pufera A i zagrijavajte na 95°C 5 – 10 min.Vrijeme lize može se na odgovarajući način produžiti za listove koje je teško lizirati (ne više od 30 min).Nakon zagrijavanja, kratko centrifugirajte i dodajte 1 μl supernatanta u PCR sistem kao reakcijski šablonb.

a.Makaze ili drugi alati se također mogu koristiti za rezanje uzoraka odgovarajuće veličine;ako se bušilica ili makaze ponovo koriste, treba ih očistiti 2% otopinom natrijum hipoklorita prije svake upotrebe kako bi se spriječila unakrsna kontaminacija između uzoraka.

b.Uvjerite se da je pufer za direktnu lizu biljaka potpuno otopljen prije upotrebe.Ako je pufer viskozan ili ima talog, može se zagrijati na 37 ℃ da se potpuno otopi prije upotrebe.

c.Volumen šablona u reakcionom sistemu može se podesiti na odgovarajući način prema razlici u zapremini biljnog materijala i dodanog razblaživača.

Biljni pufer za direktnu lizu

Pufer za direktnu lizu biljaka A koji se nalazi u ovom proizvodu je striktno optimizovan za oslobađanje genoma većine biljnih tkiva i pogodan je za kratkotrajno skladištenje sirovih biljaka na 4℃.Ako uzorak treba da se čuva na duži vremenski period (npr. 1 – 2 meseca), preporučuje se da se supernatant prebaci u novu EP epruvetu i čuva na -20℃.Da biste stabilnije pohranili uzorke, dodajte jednaku količinu pufera za direktnu lizu biljaka B u prebačeni supernatant, dobro promiješajte i čuvajte na -20 ℃.Stabilno vrijeme skladištenja varira u zavisnosti od biljnih uzoraka i stanja.

Reakcioni sistem

a.Sadrži Mg²⁺pri konačnoj koncentraciji od 2 mM.

b.Preporučuje se upotreba konačne koncentracije od 0,4 μM za svaki prajmer.Prekomjerna upotreba prajmera će dovesti do povećanog nespecifičnog pojačanja.

c.Količina korištenog uzorka može se prilagoditi prema stvarnoj situaciji.Količina korištena u jednoj reakciji sirovog liziranog uzorka može se podesiti između 2% – 20% ukupnog volumena reakcije.Upotreba previše uzoraka može uzrokovati neuspjeh pojačanja.

Reaction Program

a.Početna denaturacija (98℃, 5 min) potiče lizu biljnog tkiva, oslobađajući genomsku DNK koja se može koristiti za PCR amplifikaciju.Nemojte skraćivati ​​vrijeme ili snižavati temperaturu.

b.Preporučuje se da se podesi jednakim vrijednosti Tm prajmera ili 2 ~ 4℃ više od vrijednosti Tm.DNK polimeraza sa direktnim umnožavanjem koja se koristi u ovom proizvodu razlikuje se od konvencionalne Taq DNK polimeraze i ima posebne zahtjeve za reakcijsku temperaturu žarenja; upotreba visoke temperature žarenja može efikasno smanjiti nespecifično pojačanje i poboljšati efikasnost amplifikacije.Za složene šablone, efikasno pojačanje se može postići podešavanjem temperature žarenja i produžavanjem vremena ekstenzije.

c.Ako je dužina proizvoda za pojačavanje ≤1 kb, vrijeme ekstenzije se postavlja na 30 sec/kb;ako je dužina proizvoda za pojačavanje >1 kb, vrijeme ekstenzije se postavlja na 60 sec/kb.

d.Za složene uzorke ili uzorke sa niskim prinosom amplifikacije, broj ciklusa se može na odgovarajući način povećati na 40 -50 ciklusa.

Prijave

Primjenjiv je za direktno amplifikaciju biljnih tkiva i visoko propusni pregled biljnih uzoraka koji ne sadrže polisaharide i polifenole.

Bilješke

Samo za istraživačku upotrebu.Nije za upotrebu u dijagnostičkim procedurama.

1. Za amplifikaciju sirove biljke ili direktno amplifikaciju, preporučuje se korištenje prečišćene genomske DNK kao pozitivne kontrole prije početka eksperimenta kako bi se osiguralo da su sistem, prajmeri i operacije ispravni.

2. Direktna amplifikacija DNK polimeraze koja se koristi u ovom kompletu ima snažnu lektorsku aktivnost.Ako je potrebno izvršiti TA kloniranje, preporučuje se pročišćavanje DNK prije dodavanja adenina.

3. Vodič za dizajn prajmera:

a.Preporučuje se da posljednja baza na 3′ kraju prajmera bude G ili C.

b.Treba izbegavati uzastopna neslaganja u poslednjih 8 baza na 3′ kraju prajmera.c.Izbjegavajte strukture ukosnica na 3′ kraju prajmera.

d.Razlike u vrijednosti Tm prednjeg prajmera i obrnutog prajmera ne bi trebalo da budu veće od 1℃, a vrednost Tm treba da se podesi na 60 ~ 72℃ (Preporučuje se Primer Premier 5 za izračunavanje vrednosti Tm).

e.Dodatne dodatne sekvence prajmera koje se ne podudaraju sa šablonom ne bi trebale biti uključene prilikom izračunavanja vrednosti Tm prajmera.

f.Preporučuje se da GC sadržaj prajmera bude 40% -60%.

g.Ukupna distribucija A, G, C i T u prajmeru treba da bude što je moguće ravnomernija.Izbjegavajte korištenje regija s visokim sadržajem GC ili AT.

h.Izbjegavajte prisustvo komplementarnih sekvenci od 5 ili više baza bilo unutar prajmera ili između dva prajmera i izbjegavajte prisustvo komplementarnih sekvenci od 3 ili više baza na 3′ kraju dva prajmera.

i.Koristite funkciju NCBI BLAST da provjerite specifičnost prajmera kako biste spriječili nespecifično pojačanje.