RTL reverzna transkriptaza
RTL reverzna transkriptaza je DNK polimeraza zavisna od RNA šablone kojoj nedostaje aktivnost 3'→5' egzonukleaze i ima aktivnost RNaze H.Ovaj enzim može koristiti RNK kao šablon za sintezu komplementarnog lanca DNK, koji se može primijeniti na sintezu cDNK prvog lanca, posebno za RT-LAMP (izotermna amplifikacija posredovana petljom).U poređenju sa RTL reverznom transkriptazom 1.0, osetljivost je značajno poboljšana, termička stabilnost je jača, a reakcija na 65°C je stabilnija.RTL reverzna transkriptaza (bez glicerola) može se koristiti za pripremu liofiliziranih preparata, liofiliziranih RT-LAMP reagensa itd.
Definicija jedinice
Jedna jedinica inkorporira 1 nmol dTTP-a u materijal koji se može taložiti u kiselini za 20 minuta na 50°C koristeći poli(A)•oligo(dT)25 kao šablonski prajmer.
Komponente
| Komponenta | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL reverzna transkriptaza (bez glicerola) (15U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10×HC RTL pufer | 1,5 mL | 4×1,5 mL | 5×10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 mL | 2×1,5 mL | 3×10 mL |
Stanje skladištenja
Transportovati na temperaturi od 0°C i čuvati na -25°C~-15°C.
Kontrola kvaliteta
- Preostala aktivnost odEdonukleaza:Reakcija od 50 μL koja sadrži 1 μg λDNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubiranih 16 sati na 37 ℃ pokazuje isti obrazac kao negativna kontrola gel elektroforezom.
- Preostala aktivnost odEgzonukleaza:Reakcija od 50 μL koja sadrži 1 μg Hind Ⅲ digestirane λDNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubiranih 16 sati na 37 ℃ pokazuje isti obrazac kao negativna kontrola gel elektroforezom.
- Preostala aktivnost odNickase:Reakcija od 50 μL koja sadrži 1 μg supersmotanog pBR322 i 15 jedinica RTL2.0 inkubiranih 4 sata na 37°C pokazuje isti obrazac kao negativna kontrola gel elektroforezom.
- Preostala aktivnost odRNase:Reakcija od 10 μL koja sadrži 0,48 μg MS2 RNA i 15 jedinica RTL2.0 inkubiranih 4 sata na 37°C pokazuje isti obrazac kao negativna kontrola gel elektroforezom.
- E. coli gDNK:Izmjereno saE.colispecifični HCD kompleti za detekciju, 15 jedinica RTL2.0 sadrži manje od 1E. coligenom.
Reaction Setup
cDNA Synthesis Protocol
| Komponente | Volume |
| Template RNA a | opciono |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) ili Random Primer mix (60uM) | 2 μL |
| dNTP miks (10mM svaki) | 1 μL |
| Inhibitor RNaze (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL reverzna transkriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL pufer | 2 μL |
| Voda bez nukleaza | Do 20 μL |
napomene:
1) Preporučena doza ukupne RNK je 1ng~1μg
2) Preporučena doza mRNA bila je 50ng~100ng
Thermo-biciklizam Uslovi za rutinu reakcija:
| temperatura (°C) | Vrijeme |
| 25 °Ca | 5mins |
| 55 °C | 10minsb |
| 80 °C | 10mins |
napomene:
1) Ako se koristi Random Primer Mix, korak inkubacije na 25°C.
2) Ako se koristi ciljna mješavina prajmera, korak inkubacije na 55°C u trajanju od 10~30 minuta.
RT-LAMP protokol
| Komponente | Volume | Konačna koncentracija |
| Template RNA | opciono | ≥10 kopija |
| dNTP miks (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP prajmeri (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 Primeri (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB prajmeri (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibitor RNaze (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reakcija |
| RTL reverzna transkriptaza 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/reakcija |
| Bst V2 DNK polimeraza (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reakcija |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (ukupno 8 mM) |
| 10×HC RTL bafer (ili 10×HC Bst V2 bafer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Voda bez nukleaza | Do 25 μL | - |
napomene:
1) Promiješajte vorteksiranjem i kratko centrifugirajte da se skupi.Inkubacija na konstantnoj temperaturi na 65°C 1 sat.
2) Dva bafera su interoperabilna i imaju isti sastav.
Bilješke
1. Ovaj proizvod će formirati bijelu čvrstu supstancu kada se čuva na -20 °C.Izvadite sa -20°C i stavite na led oko 10 minuta.Nakon topljenja može se koristiti protresanjem i miješanjem.
2. cDNK proizvod se može čuvati na -20°C ili -80°C ili odmah koristiti za PCR reakciju.
3. Da biste spriječili kontaminaciju RNase, održavajte eksperimentalno područje čistim i nosite čiste rukavice i maske tokom rada.
