Uracil DNK glikozilaza
Uracil-DNA glikozilaza (UNG ili UDG) je rekombinantni klon E.coli sa molekulskom težinom od 25 kDa.On katalizuje oslobađanje slobodnog uracila iz jednolančane i dvolančane DNK koja sadrži uracil, neaktivan je protiv RNK i može se koristiti za sprječavanje kontaminacije proizvoda PCR amplifikacije.Princip djelovanja zasniva se na činjenici da ako se dUTP u PCR reakciji zamijeni dTTP-om i nastane proizvod PCR amplifikacije koji sadrži dU baze, enzim može selektivno razbiti glikozidnu vezu U baza u jednolančanim i dvolančanim DNK i degradirati proizvod PCR amplifikacije.
Preporučena aplikacija
Pojačavanje prevencije kontaminacije
Stanje skladištenja
-20°C za dugotrajno skladištenje, treba dobro promešati pre upotrebe, izbegavati često zamrzavanje-odmrzavanje.
Međuspremnik za pohranu
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stabilizator, 50% glicerol.
Definicija jedinice
Količina enzima potrebna za razgradnju 1 µg jednolančane DNK koja sadrži dU baze za 1 sat na 37°C je 1 jedinica.
Kontrola kvaliteta
1.SDS-PAGE elektroforetska čistoća veća od 98%
2.Osetljivost pojačanja, kontrola od serije do serije, stabilnost
3.Nakon što se 1U UNG tretira na 50℃ u trajanju od 2 minute, šablon koji sadrži U ispod 103 kopije bi trebao biti potpuno degradiran i ne može se proizvesti proizvod za pojačavanje
4.Nema egzogene aktivnosti nukleaze
Instrukcije
| Komponente | Zapremina (μL) | Konačna koncentracija |
| 10 × PCR pufer (bez dNTP, Mg²+besplatno) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (zamijeni dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Prajmer Mixa | 2 | 1× |
| Predložak | - | <1μg/reakcija |
| ddH₂O | Do 50 | - |
Bilješka: a: Ako se koristi za qPCR/qRT-PCR, fluorescentnu sondu treba dodati u reakcioni sistem.Obično, konačna koncentracija prajmera od 0,2 μM može dati dobre rezultate;kada je učinak reakcije loš, koncentracija prajmera može se podesiti u rasponu od 0,2-1 μM.Obično se koncentracija sonde optimizira u rasponu od 0,1-0,3 μM.Eksperimenti sa gradijentom koncentracije mogu se izvesti kako bi se pronašla najbolja kombinacija prajmera i sonde.
Bilješke
1.UNG enzim se može koristiti za uklanjanje kontaminiranih produkata dUTP amplifikacije iz reakcionog sistema prije reakcije PCR amplifikacije, a zatim da bi se izbjegli lažno pozitivni rezultati zbog kontaminacije proizvoda.
2.Optimalna temperatura za UNG enzim koji se koristi u PCR reakciji protiv kontaminacije je općenito 50℃ za 2 minute;stanje inaktivacije je 95℃ za 5 minuta.
3.Izbjegavajte često zamrzavanje-odmrzavanje i ne izlažite velikim temperaturnim oscilacijama.
4.Različiti geni koji se amplificiraju imaju različitu iskoristivost dUTP-a i osjetljivost na enzim UNG, stoga, ako korištenje UNG sistema dovodi do smanjenja osjetljivosti detekcije, reakcioni sistem treba prilagoditi i optimizirati, ako vam je potrebna tehnička podrška, obratite se naša kompanija.
