Superstart qPCR Premix plus-UNG
Kataloški broj: HCB5071E
Superstart qPCR Premix plus-UNG je specijalizovani reagens dizajniran za kvalitativne i kvantitativne reakcije PCR u realnom vremenu koristeći detekciju baziranu na sondi, razvijen posebno za procese liofilizacije.Sadrži novi hot-start enzim Hotstart Taq plus (DG), čija je aktivnost Taq enzima zatvorena na sobnoj temperaturi, efektivno inhibirajući nespecifično pojačanje uzrokovano nespecifičnim žarenjem prajmera ili formiranjem dimera prajmera u uslovima niske temperature, čime se poboljšava specifičnost reakcije amplifikacije.Ovaj reagens koristi optimizirani qPCR specifičan pufer i UNG/dUTP sistem za zaštitu od kontaminacije kako bi se postigao brzi vrući start, značajno poboljšavajući efikasnost i osjetljivost qPCR reakcija.Može da dobije dobre standardne krive u širokom rasponu kvantitacionih oblasti i precizno izvrši kvantitaciju, efikasno sprečavajući lažno pozitivnu amplifikaciju uzrokovanu rezidualnim PCR proizvodima ili kontaminacijom aerosolom.Ovaj reagens je kompatibilan sa većinom fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumenata proizvođača kao što su Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche itd., i pokazuje dobru stabilnost u liofiliziranom obliku.
Sastav reagensa
1. 5×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+besplatno) (DG)
2. 250 mM MgCl2
3. 4×lioprotektor (opciono)
Uslovi skladištenja
Dugotrajno skladištenje na -20℃;može se čuvati na 4℃ do 3 mjeseca.Prije upotrebe dobro promiješati iizbjegavajte ponovno zamrzavanje i odmrzavanje.
Cycling Protocol
| Procedura | Temp. | Vrijeme | Ciklus |
| Varenje | 50℃ | 2 min | 1 |
| Aktivacija polimeraze | 95℃ | 1~5 min | 1 |
| Denatura | 95℃ | 10~20 s | 40-50 |
| Žarenje i ekstenzija | 56~64℃ | 20~60 s | 40-50 |
qPCR Liquid Reaction Sypriprema stabljike
|
Kompozicija |
25µL Volumen |
50µL Volumen |
Konačna koncentracija |
| 5×HotstartPremix plus-UNG(Mg2+besplatno) (DG) | 5µL | 10µL | 1× |
| 250mM MgCl2 | 0,45µL | 0,9µL | 4,5 mM |
| 4×lyoprotectant1 | 6,25µL | 12,5µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Predložak DNK3 | —— | —— | —— |
| ddH2O | Do 25µL | Do 50µL | —— |
1. Konačna koncentracija od 0,2 μM za prajmere obično daje dobre rezultate;kada je učinak reakcije loš, prilagodite koncentraciju prajmera u rasponu od 0,2-1 μM po potrebi.Koncentracija sonde se obično optimizira u rasponu od 0,1-0,3 μM kroz eksperimente s gradijentom kako bi se pronašle optimalne kombinacije.
2. Broj kopija ciljnih gena sadržanih u različitim tipovima šablona varira;ako je potrebno, gradijentno razrjeđivanje se može izvršiti kako bi se odredila optimalna količina dodatka šablona.
3. Ovaj sistem se može liofilizirati;kada korisnici koriste ovaj sistem bez zahtjeva za sušenje zamrzavanjem, 4× lioprotektant se može selektivno dodati; ako su potrebni proizvodi osušeni zamrzavanjem, tokom faze validacije performansi proizvoda u fazi tekućih reagensa, mora se dodati 4× lioprotektant kako bi se osigurala konzistentnost sa komponentama liofiliziranog sistema i efekte.
Kada se sistem koristid za sušenje zamrzavanjem, pripremite sistem as sljedeće:
| Kompozicija | 25µL Reakcioni sistem |
| 5 ×HotstartPremix plus-UNG (Mg2+besplatno) (DG) | 5µL |
| 250mM MgCl2 | 0,45µL |
| 4×lyoprotectant | 6,25µL |
| 25×Primer-Probe Mix | 1µL |
| ddH2O | Do 18~20µL |
* Ako su potrebni drugi sistemi za sušenje zamrzavanjem, obratite se posebno.
Liophilization Process
| Procedura | Temp. | Vrijeme | Stanje | Pritisak |
| Prethodno zamrzavanje | 4℃ | 30 min | Čekaj |
1 atm |
| -50℃ | 60 min | Hlađenje | ||
| -50℃ | 180 min | Čekaj | ||
| Primarno sušenje | -30℃ | 60 min | Grijanje |
Ultimate Vacuum |
| -30℃ | 70 min | Čekaj | ||
| Sekundarno sušenje | 25℃ | 60 min | Grijanje |
Ultimate Vacuum |
| 25℃ | 300 min | Čekaj |
2. Gore navedeni proces liofilizacije je samo za referencu.Različiti tipovi proizvoda i različiti uređaji za sušenje zamrzavanjem imaju različite parametre, tako da se prilagođavanja mogu izvršiti u skladu sa stvarnimuslovima tokom upotrebe.
3. Različiti procesi liofilizacije mogu biti prikladni za različite veličine serija liofiliziranihproizvoda, tako da se mora izvršiti dovoljna validacija testiranja kada se koristi za proizvodnju velikih razmjera.
Uputstvo za upotrebu liofilizad prah
1. Kratko centrifugirajte liofilizirani prah;
2. Dodajte šablon nukleinske kiseline liofiliziranom prahu i dodajte vodu do 25 µL;
3. Dobro promiješati centrifugiranjem i staviti na mašinu.
Kontrola kvaliteta:
1. Funkcionalno testiranje: osjetljivost, specifičnost, reproduktivnost qPCR-a.
2. Nema egzogene aktivnosti nukleaze, nema egzogene endo/egzonukleazne kontaminacije.
Tehničke informacije:
1. Superstart qPCR Premix plus-UNG koristi novi hot-start enzim koji omogućava brzo pokretanje vruće u roku od 1~5 minuta;kroz posebnu formulaciju pufera pogodan je za multipleksne fluorescentne kvantitativne PCR reakcije.
2. Ima veću specifičnost koja značajno poboljšava osjetljivost kvantitativnog PCR detekcije fluorescencije, normalizujući krivulje amplifikacije, vrijednost fluorescencije postiže očito poboljšanje na šablonima niske koncentracije, pogodne kao visokoosjetljivi fluorescentni kvantitativni PCR reagensi za detekciju.
3. Za prajmere sa nižom temperaturom žarenja ili fragmentima dužim od 200 bp, preporučuje se metoda u 3 koraka.
4. Efikasnost korištenja dUTP-a i osjetljivost na UNG enzim se razlikuju za različite ciljne gene, pa ako korištenje UNG sistema dovodi do smanjenja osjetljivosti detekcije, reakcioni sistem treba prilagoditi i optimizirati.Ako je potrebna tehnička podrška, obratite se našoj kompaniji.
5. Koristite namenske oblasti i pipete pre i posle amplifikacije, nosite rukavice tokom rada i često ih menjajte;ne otvarajte reakcijsku epruvetu nakon završetka PCR-a kako biste sveli na minimum kontaminaciju uzoraka PCR proizvodima.
