Hotstart Taq DNK polimeraza
Hot Start Taq DNK polimeraza (modifikacija antitijela) je termostabilna DNK polimeraza s vrućim startom iz Thermus aquaticus YT-1, koja posjeduje aktivnost 5′→3′ polimeraze i 5´ klapnu endonukleaznu aktivnost.Hot-start Taq DNK polimeraza je Taq DNK polimeraza koja je modificirana termolabilnim Taq antitijelima.Modifikacija antitijela povećala je specifičnost, osjetljivost i prinos PCR-a.
Komponente
| Komponenta | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq pufer | 4×1 mL | 4×10 mL | 4×50 mL | 5×400 mL |
| Hot Start Taq DNK polimeraza (modificirana antitijela) (5 U/μL) | 0,1 mL | 1 mL | 5 mL | 10×5 mL |
Prijave
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 na 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitola, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 i 50% glicerola.
Stanje skladištenja
Transportovati na temperaturi od 0°C i čuvati na -25°C~-15°C.
Definicija jedinice
Jedna jedinica je definirana kao količina enzima koja inkorporira 15 nmol dNTP u materijal nerastvorljiv u kiselini za 30 minuta na 75°C.
Kontrola kvaliteta
1.Endonuclease Activity:Inkubacija 20 U enzima sa 4 μg pUC19 DNK tokom 4 sata na 37℃ nije rezultirala degradacijom DNK koja se nije mogla detektovati kao što je utvrđeno gel elektroforezom.
2.5 kb Lambda PCR:25 ciklusa PCR amplifikacije 5 ng Lambda DNK sa 1,25 jedinica Taq DNK polimeraze u prisustvu 200 µM dNTP-a i 0,2 µM prajmera rezultira očekivanim 5 kb proizvoda.
3.Exonuclease Activity:Inkubacija reakcije od 50 µl koja sadrži najmanje 12,5 U Taq DNK polimeraze sa 10 nmol 5´-FAM oligonukleotida u trajanju od 30 minuta na 37 ℃ ne daje vidljivu degradaciju.
4.Aktivnost RNase:Inkubacija 10 µL reakcije koja sadrži 20 U enzima sa 1 μg RNA transkripata tokom 2 sata na 37°C nije rezultirala degradacijom RNK koja se nije mogla detektovati kao što je utvrđeno gel elektroforezom.
5.Inaktivacija topline:br.
Reakcioni sistem
| Komponente | Volume |
| Predložak DNKa | opciono |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| dNTP miks (10mM svaki) | 0,5 μL |
| 5×HC Taq pufer | 5 μL |
| Taq DNK polimerazab(5U/μL) | 0,125 μL |
| Voda bez nukleaza | Do 25 μL |
napomene:
1) a.
| DNK | Iznos |
| Genomski | 1 ng-1 μg |
| Plazmid ili virus | 1 pg-1 ng |
2) b.Optimalna koncentracija Taq DNK polimeraze može se kretati od 5-50 jedinica/mL (0,1-0,5 jedinica/25 µL reakcija) u specijalizovanim aplikacijama.
Protokol termičkog ciklusa
PCR
| Korak | Temperatura(°C) | Vrijeme | Ciklusi |
| Početna denaturacijaa | 95 ℃ | 1-3mins | - |
| Denaturacija | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 ciklusa |
| Žarenjeb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Produžetak | 68 ℃ | 1kb/min | |
| Final Extension | 68 ℃ | 5mins | - |
napomene:
1) Početna denaturacija od 1 min na 95°C dovoljna je za većinu amplifikacija.Za teške šablone preporučuje se duža denaturacija od 2-3 minute na 95°C.Kod PCR-a kolonija preporučuje se početna denaturacija od 5 minuta na 95°C.
2) Korak žarenja je tipično 15-60 s.Temperatura žarenja se zasniva na Tm para prajmera i obično je 45-68℃.
