Proteinaza K NGS (prašak)
Kataloški broj: HC4507A
NGS Proteaza K je stabilna serinska proteaza sa visokom enzimskom aktivnošću i širokom specifičnošću supstrata. Enzim prvenstveno razgrađuje estarske veze i peptidne veze u blizini C-terminala hidrofobnih amino kiselina, aminokiselina koje sadrže sumpor i aromatičnih aminokiselina.Dakle, često se koristi za razgradnju proteina u kratke peptide.NGS proteaza K je tipična serinska proteaza sa Asp39-Njegov69-Ser224katalitička trijada koja je jedinstvena za serinske proteaze, a katalitički centar je okružen vučom Ca2+vezna mjesta za stabilizaciju, održavajući visoku aktivnost enzima u širem rasponu uslova.
Specifikacija
| Izgled | Bijeli do sivobijeli amorfni prah, liofiliziran |
| Specifična aktivnost | ≥40U/mg čvrste supstance |
| DNase | Nije otkriveno |
| RNase | Nije otkriveno |
| Bioburden | ≤50CFU/g čvrste supstance |
| Ostatak nukleinske kiseline | <5 pg/mg čvrste supstance |
Svojstva
| Izvor | Tritirachium album |
| EC broj | 3.4.21.64(Rekombinant iz albuma Tritirachium) |
| Molekularna težina | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična tačka | 7.81 Sl.1 |
| Optimalni pH | 7.0-12.0 (Svi imaju visoku aktivnost) Sl.2 |
| Optimalna temperatura | 65℃ Sl.3 |
| pH stabilnost | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Sl.4 |
| Termička stabilnost | Ispod 50℃ (pH 8,0, 30 min) Sl.5 |
| Stabilnost skladištenja | Čuvano na 25℃ 12 meseci Sl.6 |
| Aktivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | Diizopropil fluorofosfat;benzilsulfonil fluorid |
Uslovi skladištenja
Čuvajte liofilizirani prah na -25~-15 ℃ dugo vremena daleko od svjetlosti;Nakon rastvaranja, alikvot u odgovarajuću zapreminu za kratkotrajno skladištenje na 2-8℃ daleko od svetlosti ili dugotrajno skladištenje na -25~-15 ℃ daleko od svetlosti.
Mjere predostrožnosti
Nosite zaštitne rukavice i zaštitne naočale kada koristite ili vagate, a nakon upotrebe održavajte ga dobro prozračenim.Ovaj proizvod može izazvati alergijsku reakciju kože i ozbiljnu iritaciju očiju.Ako se udiše, može izazvati alergiju ili simptome astme ili dispneju.Može izazvati iritaciju disajnih puteva.
Definicija jedinice
Jedna jedinica NGS proteaze K je definisana kao količina enzima potrebna za hidrolizu kazeina u 1 μmol L-tirozina pod standardnim uslovima određivanja.
Priprema reagensa
| Reagens | Proizvođač | Katalog |
| Kazein tehničkiod goveđeg mleka | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trihlorosirćetna kiselina | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrijum acetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Sirćetna kiselina | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natrijum karbonat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Šangaj)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
Reagens I:
Supstrat: 1% kazeina iz rastvora goveđeg mleka: rastvoriti 1 g kazeina od goveđeg mleka u 50 ml 0,1 M rastvora natrijum fosfata, pH 8,0, zagrevati u vodenom kupatilu na 65-70 °C 15 minuta, promešati i rastvoriti, ohladiti vodom, podesiti natrijum hidroksida do pH 8,0 i razblažiti u 100 ml.
Reagens II:
TCA rastvor: 0,1M trihloroctene kiseline, 0,2M natrijum acetata i 0,3M sirćetne kiseline (izmeriti 1,64g trihloroctene kiseline + 1,64g natrijum acetata + 1,724mL sirćetne kiseline uzastopno, dodati 50mL dejonizovane vode, podesiti pH sa 4.HCl na 4.HCl 100ml).
Reagens III:
0,4 m rastvora natrijum karbonata (izmeriti 4,24 g bezvodnog natrijum karbonata i rastvoriti u 100 ml vode)
Reagens IV:
Folin fenol reagens: razrijediti 5 puta dejoniziranom vodom.
Reagens V:
Enzimski razblaživač: 0,1 M rastvor natrijum fosfata, pH 8,0.
Reagens VI:
Standardni rastvor L-tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozin rastvoren sa 0,2M HCl.
Procedura
1. Uključite UV-Vis spektrofotometar i odaberite fotometrijsko mjerenje.
2. Postavite talasnu dužinu na 660nm.
3. Uključite vodeno kupatilo, podesite temperaturu na 37℃, obezbedite da temperatura ostane nepromenjena 3-5 minuta.
4. Prethodno zagrijte 0,5 mL supstrata u epruveti za centrifugiranje od 2 mL na 37 ℃ vodenom kupatilu 10 minuta.
5. Ekstrahirajte 0,5 mL razrijeđenog rastvora enzima u prethodno zagrijanu epruvetu za centrifugiranje 10 minuta.Postavite enzimski razblaživač kao praznu grupu.
6. Dodajte 1,0 mL TCA reagensa odmah nakon reakcije.Dobro promiješajte i inkubirajte u vodenom kupatilu 30 minuta.
7. Centrifugirajte reakcijsku otopinu.
8. Dodajte sljedeće komponente navedenim redoslijedom.
| Reagens | Volume |
| Supernatant | 0,5 mL |
| 0,4M natrijum karbonat | 2,5 mL |
| Folin fenol reagens | 0,5 mL |
9. Dobro promešajte pre inkubacije u vodenom kupatilu na 37℃ tokom 30 minuta.
10. OD660je određen kao OD1;prazna kontrolna grupa: Enzimski razblaživač se koristi za zamenu rastvora enzima za određivanje OD660kao OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 mL rastvora L-tirozina različite koncentracije, 2,5 mL 0,4 M natrijum karbonata, 0,5 mL Folin fenolnog reagensa u epruveti za centrifugiranje od 5 mL, inkubirajte na 37 ℃ 30 minuta, detektujte OD660za različite koncentracije L-tirozina, tada je dobijena standardna kriva Y=kX+b, gdje je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Kalkulacija
2: Ukupna zapremina reakcionog rastvora (mL)
0,5: Volumen rastvora enzima (mL)
0,5: Zapremina reakcione tečnosti koja se koristi u hromogenom određivanju (mL)
10: Vrijeme reakcije (min)
Df: Višestruko razrjeđivanje
C: Koncentracija enzima (mg/mL)
Brojke
Slika 1 DNK ostatak
| Uzorak | Ave C4 | Nukleinska kiselina oporavak (pg/mg) | Oporavak(%) | Total Nucleic kiselina ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O bez RNA | Neodređeno | — | — | — |
Slika 2 Optimalni pH
Slika 3 Optimalna temperatura
Slika 4 pH stabilnost
Slika 5. Termička stabilnost
Slika 6 Stabilnost skladištenja na 25℃
