EndoFree Plasmid Maxi komplet
Ovaj komplet je pogodan za ekstrakciju iz 150 – 300 ml bakterijske otopine kultivirane preko noći, koristeći poboljšanu SDS-alkalnu metodu lize za lizu bakterija.Sirovi ekstrakt se selektivno kombinuje sa jedinstvenim čistačem endotoksina i odvaja se centrifugiranjem kako bi se uklonili endotoksini.Zatim se membrana silika gela selektivno vezuje za plazmidnu DNK u rastvoru u uslovima visokog sadržaja soli i niskog pH.Nakon toga slijedi dodavanje pufera za pranje kako bi se uklonile nečistoće i druge bakterijske komponente.Konačno, pufer za eluiranje s niskim sadržajem soli i visokim pH koristi se za eluiranje čiste plazmidne DNK iz membrane silikonskog matriksa.Silika gel membrana koristi posebnu adsorpcionu membranu, a razlika u količini adsorpcije između kolone i kolone je vrlo mala i ponovljivost je dobra.Fenol, hloroform i drugi toksični reagensi nisu potrebni, kao ni koraci precipitacije etanola.Ovaj komplet se može koristiti za brzu ekstrakciju 0,2 -1,5 mg čiste visoke kopije plazmidne DNK, sa stopom ekstrakcije od 80% -90%.Komplet koristi jedinstvenu formulu procesa uklanjanja endotoksina, sadržaj endotoksina je izuzetno nizak, a učinak ćelijske transfekcije je odličan.Ekstrahovani plazmid mogao bi se direktno koristiti u enzimskoj digestiji, PCR-u, in vitro transkripciji, transformaciji, sekvenciranju i drugim eksperimentima molekularne biologije.
Uslovi skladištenja
RNAseA treba čuvati na -30 ~ -15℃ i transportovati na ≤0℃.
Endotoksin Scavenger se može čuvati na 2 ~ 8 ℃ tokom jednog meseca, čuvati na -30 ~ -15 ℃ za dugotrajno skladištenjei transportovan na ≤0℃.
Ostale komponente treba čuvati na sobnoj temperaturi (15 ~25℃) i transportovati na sobnoj temperaturi.
Komponente
| Komponente | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Čistač endotoksina | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi kolone (svaka u tubi za prikupljanje od 50 ml) | 10 |
| Tuba za sakupljanje bez endotoksina | 2 × 5 |
RNAseA:10 mg/ml, koristi se za uklanjanje RNK.
Međuspremnik P1:pufer za suspenziju bakterija, dodajte RNAseA u pufer P1 prije prve upotrebe.
Buffer P2:bakterijski pufer za lizu (koji sadrži SDS/NaOH).
Buffer P4:neutralizujući pufer.
Čistač endotoksina:efikasno uklanja endotoksin iz sirovog ekstrakta plazmida.
Buffer PW:pufer za pranje, dodajte propisanu količinu etanola prije prve upotrebe.
Buffer TB:elucioni pufer.
FastPure DNK Maxi kolone:adsorpcione kolone za plazmidnu DNK.
Tube za sakupljanje 50 ml:cijevi za sakupljanje filtrata.
Tuba za sakupljanje bez endotoksina:epruvete za prikupljanje plazmidne DNK.
Pripremljeni materijali
Apsolutni etanol, izopropanol, epruvete za centrifugiranje sa okruglim dnom od 50 ml i 50 ml bez endotoksinacentrifugalne cijevi.
Prijave
Ovaj proizvod je pogodan za veliku ekstrakciju plazmida od 150 - 300 ml bakterijske otopinekultivisan preko noći.
Proces eksperimentiranja
1. Uzmite 150 – 200 ml (ne više od 300 ml) bakterijskog rastvora kultivisanog preko noći i centrifugirajte naoko 11.000 o/min (12.000 × g) tokom 1 – 2 min.Odbacite supernatant i sakupite bakterije.
Δ Kada se prikupi više od 50 ml bakterijske otopine, bakterije se mogu prikupiti dodavanjem bakterijskog rastvora, centrifugiranjem, odbacivanjem supernatanta i drugim koracima u istu epruvetu od 50 ml za
više puta.
2. Dodajte 7,5 ml pufera P1 (molimo provjerite da li je RNAseA dodata puferu P1) u centrifuguepruveta koja sadrži bakterije i temeljito promiješajte vrtložnim miješanjem ili pipetiranjem.
Δ Potpuna resuspenzija bakterija u ovom koraku je ključna za prinos i ne bi trebalo biti bakterijskih nakupina nakon resuspenzije.Ako postoje nakupine bakterija koje nisu dobro izmiješane, to će utjecati na lizu, što će rezultirati niskim prinosom i čistoćom.Ako je OD600 bakterijske otopine 0,65, preporučuje se korištenje 7,5 ml pufera P1 kada se ekstrahira iz 150 ml bakterijske otopine;kada je OD600 0,75, treba koristiti 8 ml pufera P1 i u skladu s tim promijeniti količine pufera P2 i P4.Ako se volumen bakterijske otopine poveća na 200 ml, preporučuje se da sevolumen pufera P1, P2 i P4 se proporcionalno povećava.
3. Dodajte 7,5 ml pufera P2 u bakterijsku suspenziju iz koraka 2 i lagano miješajte gore-dolje 6 – 8puta i inkubirajte na sobnoj temperaturi 4 – 5 min.
Δ Lagano okrenite da biste dobro promešali.Vortexing će uzrokovati fragmentaciju genomske DNK, što će rezultirati fragmentima genomske DNK u ekstrahiranom plazmidu.U tom trenutku otopina postaje viskozna i prozirna, što pokazuje da su bakterije potpuno lizirane.Trajanje ne bi trebalo da prelazi 5 minuta kako bi se izbeglo uništavanje plazmida.Ako otopina nije bistra, može doći do previše bakterijanepotpuna liza, pa količinu bakterija treba na odgovarajući način smanjiti.
4. Dodajte 7,5 ml pufera P4 u bakterijsku suspenziju iz koraka 3 i odmah lagano okrenite 6 – 8 puta kako biste omogućili otopini da potpuno neutralizira pufer P2.U tom trenutku bi se trebao pojaviti bijeli flokulantni talog.Centrifugirajte na više od oko 11.000 o/min (12.000 × g) 10 – 15 minuta, pažljivo pipetirajte supernatant u novu epruvetu za centrifugiranje sa okruglim dnom od 50 ml (samopripremljenu) i izbjegavajteaspirirati plutajući bijeli talog.
Δ Dodajte pufer P4 i odmah okrenite da se dobro promiješa.Ostavite epruvetu da stoji dok se bijeli talog ne rasporedi ravnomjerno po cijeloj otopini kako bi se spriječilo stvaranje lokalnih taloga koje bi mogle utjecati na neutralizaciju.Ako prije centrifugiranja nema ujednačenog bijelog flokulentnog taloga i supernatant nije bistar nakon centrifugiranja, epruveta se možecentrifugirano još 5 min.
5. Dodajte 0,1 puta zapreminu (10% zapremine supernatanta, oko 2,2 ml) Endotoksin Scavenger u supernatant iz koraka 4 i okrenite da se meša.Otopinu stavite u ledenu kupku ili ubacite u drobljeni led (ili zamrzivač u frižideru) na 5 minuta dok se rastvor ne promeni iz mutne u bistru i prozirnu (ili još uvekblago zamućen) i povremeno promiješati nekoliko puta.
Δ Nakon što se u supernatant doda čistač endotoksina, supernatant će postati zamućen, alisupernatant bi trebao postati bistar (ili blago zamućen) nakon hlađenja u ledenom kupatilu.
6. Nakon što se supernatant stavi na sobnu temperaturu (>25℃) na 10 – 15 min, postat će mutan kaonjegova temperatura raste do sobne temperature.Zatim supernatant treba preokrenuti da se pomiješa.
Δ Ako je sobna temperatura niža ili želite da skratite vrijeme ekstrakcije, supernatant se može inkubirati u vodenoj kupelji od 37 ~ 42 ℃ 5 – 10 minuta i sljedeći korak se može izvesti nakon supernatantapostaje zamućen.
7. Centrifugirajte supernatant na oko 11.000 rpm (12.000 × g) 10 minuta na sobnoj temperaturi (temperatura mora biti >25 ℃) da biste odvojili fazu.Gornja vodena faza sadrži DNK, dok donji plavi sloj uljane faze sadrži endotoksin i druge nečistoće.Transfer theVodena faza koja sadrži DNK u novu epruvetu iodbacite masni sloj.
Δ Temperatura tokom centrifugiranja mora biti iznad 25℃ jer efektivno razdvajanje faza nijenastaju ako je temperatura preniska.
Δ Ako razdvajanje faza nije efikasno, temperatura centrifugiranja se može podesiti na 30℃ ivrijeme centrifugiranja može se povećati na 15 min.
Δ Nemojte sisati plavi masni sloj jer sadrži endotoksin i druge nečistoće.
Mehanizam
Neutralizacija resuspenzije lize
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P1
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P2
◇ Dodajte 7,5 ml pufera P4
Uklanjanje endotoksina
◇Dodajte 0,1 puta zapreminu supernatanta Endotoksin Scavenger
Vezivanje i pranje
◇ Dodajte 0,5 puta zapreminu izopropanola
◇ Dodajte 10 ml pufera PW
◇ Dodajte 10 ml pufera PW
Elucija
◇ Dodajte 1 – 2 ml pufera TB ili ddH2O bez endotoksina
