Proteinaza K (tečnost)
Kataloški broj: HC4502A
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza sa širokom specifičnošću supstrata.Razgrađuje mnoge proteine u prirodnom stanju čak i u prisustvu deterdženata.Dokazi iz studija kristalne i molekularne strukture ukazuju na to da enzim pripada porodici subtilizina s katalitičkom trijadom aktivnog mjesta (Asp39-Njegov69- Ser224).Preovlađujuće mjesto cijepanja je peptidna veza uz karboksilnu grupu alifatskih i aromatskih amino kiselina sa blokiranim alfa amino grupama.Obično se koristi zbog svoje širinespecifičnost.
Specifikacija
| Izgled | Bezbojna do svetlo smeđa tečnost |
| Aktivnost | ≥800 U/ml |
| Koncentracija proteina | ≥20 mg/ml |
| DNase | Nije otkriveno |
| RNase | Nije otkriveno |
Uslovi skladištenja
Čuvati na temperaturi od 2-8℃.
Svojstva
| EC broj | 3.4.21.64 (Rekombinant iz albuma Tritirachium) |
| Molekularna težina | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična tačka | 7.81 |
| Optimalni pH | 7.0-12.0 Sl.1 |
| Optimalna temperatura | 65 ℃ Sl.2 |
| pH stabilnost | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 h) Sl.3 |
| Termička stabilnost | Ispod 50℃ (pH 8,0, 30 min) Sl.4 |
| Aktivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | Diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Prijave
1. Genetski dijagnostički komplet
2. Kompleti za ekstrakciju RNK i DNK
3. Ekstrakcija neproteinskih komponenti iz tkiva, razgradnja proteinskih nečistoća, kao što su DNK vakcine i priprema heparina
4. Priprema hromozomske DNK pulsnom elektroforezom
5. Western blot
6. Enzimski glikozilovani albuminski reagensi in vitro dijagnostika
Mjere predostrožnosti
Nosite zaštitne rukavice i zaštitne naočale kada koristite ili vagate, a nakon upotrebe održavajte ga dobro prozračenim.Ovaj proizvod može izazvati alergijsku reakciju kože i ozbiljnu iritaciju očiju.Ako se udiše, može izazvati alergiju ili simptome astme ili dispneju.Može izazvati iritaciju disajnih puteva.
Test
Definicija jedinice
Jedna jedinica (U) je definirana kao količina enzima potrebna za hidrolizu kazeina za proizvodnju 1 μmol tirozina u minuti pod sljedećim uvjetima.
Priprema reagensa
Reagens I: 1 g mlečnog kazeina je otopljen u 50 ml 0,1 M rastvora natrijum fosfata (pH 8,0), inkubiran u vodi na 65-70 ℃ 15 minuta, mešan i otopljen, ohlađen vodom, podešen natrijum hidroksidom na pH 8,0 i fiksiran zapremina 100ml.
Reagens II: TCA rastvor: 0,1 M trihlorosirćetna kiselina, 0,2 M natrijum acetat, 0,3 M sirćetna kiselina.
Reagens III: 0,4M Na2CO3rješenje.
Reagens IV: Forint reagens razrijeđen čistom vodom 5 puta.
Reagens V: Enzimski razblaživač: 0,1 M rastvor natrijum fosfata (pH 8,0).
Reagens VI: rastvor tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozin rastvoren sa 0,2M HCl.
Procedura
1. 0,5 ml reagensa I je prethodno zagrejano na 37℃, dodati 0,5ml rastvora enzima, dobro promešati i inkubirati na 37℃ 10 minuta.
2. Dodajte 1 ml reagensa II da zaustavite reakciju, dobro promiješajte i nastavite inkubaciju 30 minuta.
3. Centrifugirajte reakcijsku otopinu.
4. Uzmite 0,5 ml supernatanta, dodajte 2,5 ml reagensa III, 0,5 ml reagensa IV, dobro promiješajte i inkubirajte na 37 ℃ 30 minuta.
5. OD660je određen kao OD1;slijepa kontrolna grupa: 0,5 ml reagensa V koristi se za zamjenu otopine enzima za određivanje OD660kao OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 mL različite koncentracije otopine L-tirozina, 2,5 mL reagensa III, 0,5 mL reagensa IV u epruveti za centrifugiranje od 5 mL, inkubirajte na 37 ℃ 30 minuta, otkrijte OD660za različite koncentracije L-tirozina, tada je dobijena standardna kriva Y=kX+b, gdje je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Kalkulacija
2: Ukupna zapremina reakcionog rastvora (mL)
0,5: Volumen rastvora enzima (mL)
0,5: Zapremina reakcione tečnosti koja se koristi u hromogenom određivanju (mL)
10: Vrijeme reakcije (min)
Df: Višestruko razrjeđivanje
C: Koncentracija enzima (mg/mL)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Brojke
Fig. 1 Optimum pH
100mM puferski rastvor: pH6,0-8,0, Na-fosfat;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicin-NaOH. Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 2 Optimalna temperatura
Reakcija u 20 mM K-fosfatnom puferu pH 8,0.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25℃,16 h-tretman sa 50mM puferskom otopinom: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 4 Termički stabilnost
Tretman od 30 minuta sa 50 mM Tris-HCl pufera, pH 8,0.Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 5 Skladištenje stability at 25℃
