Rnase Inhibitor
Inhibitor mišje RNase je rekombinantni inhibitor mišje RNAze eksprimiran i pročišćen iz E.coli.Veže se za RNKazu A, B ili C u omjeru 1:1 putem nekovalentnog vezivanja, čime inhibira aktivnost tri enzima i štiti RNK od degradacije.Međutim, nije efikasan protiv RNaze 1, RNaze T1, S1 nukleaze, RNaze H ili RNaze iz Aspergillusa.Inhibitor mišje RNase testiran je pomoću RT-PCR, RT-qPCR i IVT mRNA, i bio je kompatibilan sa različitim komercijalnim reverznim transkriptazama, DNK polimerazama i RNA polimerazama.
U poređenju sa inhibitorima humane RNKaze, mišji inhibitor RNKaze ne sadrži dva cisteina koji su visoko osjetljivi na oksidaciju koja uzrokuje inaktivaciju inhibitora.To ga čini stabilnim pri niskim koncentracijama DTT (manje od 1 mM).Ova karakteristika ga čini pogodnim za upotrebu u reakcijama gdje su visoke koncentracije DTT štetne za reakciju (npr. RT-PCR u realnom vremenu).
Aprimjena
Ovaj proizvod se može široko koristiti u bilo kojem eksperimentu gdje je interferencija RNase moguća kako bi se izbjegla degradacija RNK, kao što su:
1.Sinteza prvog lanca cDNK, RT-PCR, RT-qPCR, itd.
2.Štiti RNK od degradacije tokom in vitro transkripcije/translacije (npr. in vitro virusni sistem replikacije).
3.Inhibicija aktivnosti RNKaze tokom odvajanja i prečišćavanja RNK.
Uslovi skladištenja
Proizvod se može čuvati na -25～- 15 ℃, važi 2 godine.
Međuspremnik za pohranu
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT i 50% glicerola.
Definicija jedinice
Količina inhibitora mišje RNase potrebne za inhibiciju aktivnosti 5 ng ribonukleaze A za 50% definirana je kao jedna jedinica (U).
Molekularna težina proteina
Molekularna težina mišjeg inhibitora RNKaze je 50 kDa.
Kontrola kvaliteta
Egzonukleaza Aktivnost:
40 U mišjeg inhibitora RNKaze sa 1 μg λ-Hind III digestira DNK na 37℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Aktivnost endonukleaze:
40 U mišjeg inhibitora RNKaze sa 1 μg λ DNK na 37 ℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Nicking Aktivnost:
40U inhibitora mišje RNaze sa 1μg pBR322 na 37℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
RNase Aktivnost:
40U inhibitora mišje RNase sa 1,6 μg MS2 RNK tokom 4 sata na 37℃ ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
E.coli DNK:
40 U mišjeg inhibitora RNKaze se testira na prisustvo genomske DNK E. coli pomoću TaqMan qPCR sa prajmerima specifičnim za lokus E. coli 16S rRNA.Kontaminacija genomske DNK E. coli je ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1. Nasilne oscilacije ili mešanje će dovesti do inaktivacije enzima.
2. Optimalni temperaturni raspon ovog inhibitora bio je 25-55 ℃, a deaktiviran je na 65 ℃ i više.
3. Aktivnosti RNase H, RNase 1 i RNase T1 nisu inhibirane mišjim inhibitorom RNase.
4. Inhibicija aktivnosti RNAze je pronađena u širokom rasponu pH (pH 5-9 su svi bili aktivni), a najveća aktivnost je uočena pri pH 7-8.
5. Pošto ribonukleaze tipično zadržavaju aktivnost u uslovima denaturacije, mora se voditi računa da se izbegne denaturacija molekula inhibitora RNaze koji su kompleksirali sa ribonukleazom.Da bi se spriječilo oslobađanje aktivne ribonukleaze, treba izbjegavati temperature veće od 50 °C i visoke koncentracije uree ili drugih denaturirajućih agenasa.
