M-MLV Neoscript reverzna transkriptaza
Neoscript reverzna transkriptaza je reverzna transkriptaza dobijena skriningom mutacije M-MLV gena porijekla i ekspresije virusa Moloney mišje leukemije u E.coli.Enzim uklanja aktivnost RNaze H, ima veću temperaturnu toleranciju i pogodan je za reverznu transkripciju na visokim temperaturama.Stoga je od pomoći za eliminaciju nepovoljnih efekata strukture visokog nivoa RNK i nespecifičnih faktora na sintezu cDNK, a ima veću stabilnost i sposobnost sinteze reverzne transkripcije.Enzim ima veću stabilnost i sposobnost sinteze reverzne transkripcije.
Komponente
1.200 U/μL Neoscript reverzna transkriptaza
2.5 × pufer prvog lanca (opciono)
* 5 × First-Strand pufer ne sadrži dNTP, molimo dodajte dNTP kada pripremate reakcijski sistem
Preporučena aplikacija
1.qRT-PCR u jednom koraku.
2.Detekcija RNA virusa.
Stanje skladištenja
-20°C za dugotrajno skladištenje, treba dobro promešati pre upotrebe, izbegavati često zamrzavanje-odmrzavanje.
Definicija jedinice
Jedna jedinica sadrži 1 nmol dTTP-a za 10 minuta na 37°C koristeći poli(A)•oligo(dT)25kao šablon/prajmer.
Kontrola kvaliteta
1.SDS-PAGE elektroforetska čistoća veća od 98%.
2.Osetljivost pojačanja, kontrola od serije do serije, stabilnost.
3.Nema aktivnosti egzogene nukleaze, nema egzogene endonukleaze ili kontaminacije egzonukleazom
Reaction Setup for First Chain Reaction Solution
1.Priprema reakcione smjese
| Komponente | Volume |
| oligo(dT)12-18 Primer ili Random Primera Ili genski specifični prajmerib | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Template RNA | Ukupna RNK≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH bez RNaze2O | Do 10 μL |
napomene:a/b: Molimo odaberite različite vrste prajmera prema vašim eksperimentalnim potrebama.
2.Zagrijte na 65°C 5 minuta i brzo ohladite na ledu 2 minute.
3.Dodajte sljedeće komponente u gornji sistem do ukupne zapremine od 20µL i lagano promiješajte:
| Komponente | Volumen (μL) |
| 5 × pufer prvog lanca | 4 |
| Neoscript reverzna transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNaze (40 U/μL) | 1 |
| dH bez RNaze2O | Do 20 μL |
4.Molimo da izvršite reakciju u skladu sa sljedećim uslovima:
(1) Ako se koristi Random Primer, reakciju treba izvesti na 25℃ tokom 10 minuta, a zatim na 50℃ tokom 30~60 minuta;
(2) Ako se koristi Oligo dT ili specifični prajmeri, reakciju treba izvesti na 50℃ u trajanju od 30~60 minuta.
5.Zagrijavajte na 95℃ 5 minuta da inaktivirate Neoscript reverznu transkriptazu i prekinete reakciju.
6.Proizvodi reverzne transkripcije mogu se koristiti direktno u PCR reakciji i fluorescentnoj kvantitativnoj PCR reakciji, ili se mogu čuvati na -20 ℃ dugo vremena.
PCR Rakcija:
1.Priprema reakcione smjese
| Komponente | Koncentracija |
| 10 × PCR pufer (bez dNTP, bez Mg²+) | 1× |
| dNTP (10mM svaki dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNK polimeraza (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Predložaka | ≤10% otopina prve lančane reakcije (2 μL) |
| ddH2O | Do 50 μL |
napomene:a: Ako se doda previše otopine prve lančane reakcije, PCR reakcija može biti inhibirana.
2.PCR Reaction Procedure
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklusi |
| Pre-denaturacija | 95℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturacija | 95℃ | 10-20 sec | 30-40 |
| Žarenje | 50-60℃ | 10-30 sec | |
| Produžetak | 72℃ | 10-60 sek |
Bilješke
1.Pogodno za optimizaciju temperature reverzne transkripcije u rasponu od 42℃~55℃.
2.Ima bolju stabilnost, pogodan je za visokotemperaturno pojačanje reverzne transkripcije.Osim toga, povoljan je za efikasno prolazak kroz složene strukturne regije RNK.Takođe, topogodan je za kvantitativnu RT-PCR detekciju multipleksne fluorescencije u jednom koraku.
3.Dobra kompatibilnost sa različitim enzimima PCR amplifikacije i pogodan je za RT-PCR reakcije visoke osjetljivosti.
4.Pogodno za kvantitativnu RT-PCR reakciju fluorescencije visoke osjetljivosti u jednom koraku, efikasno poboljšava stopu detekcije niske koncentracije šablona.
5.Pogodno za izgradnju cDNK biblioteke.
