Proteinaza K mNGS (tečnost)
Proteinaza K je stabilna serinska proteaza sa širokom specifičnošću supstrata.Razgrađuje mnoge proteine u prirodnom stanju čak i u prisustvu deterdženata.Dokazi iz studija kristalne i molekularne strukture ukazuju na to da enzim pripada porodici subtilizina s katalitičkom trijadom aktivnog mjesta (Asp39-Njegov69-Ser224).Preovlađujuće mjesto cijepanja je peptidna veza uz karboksilnu grupu alifatskih i aromatskih amino kiselina sa blokiranim alfa amino grupama.Obično se koristi zbog svoje široke specifičnosti.Ova proteinaza K je posebno dizajnirana za mNGS.U poređenju sa drugom proteinazom K, sadrži čak i manje kontaminacije nukleinskom kiselinom sa istim enzimskim performansama, što bi moglo bolje osigurati daljnju primjenu mNGS-a.
Uslovi skladištenja
2-8℃ tokom 2 godine
Specifikacija
| Izgled | Bezbojna do svetlo smeđa tečnost |
| Aktivnost | ≥800 U/ml |
| Koncentracija proteina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Nije otkriveno |
| DNase | Nije otkriveno |
| RNase | Nije otkriveno |
Svojstva
| EC broj | 3.4.21.64(Rekombinant iz albuma Tritirachium) |
| Izoelektrična tačka | 7.81 |
| Optimalni pH | 7.0- 12.0 Slika 1 |
| Optimalna temperatura | 65 ℃ Slika 2 |
| pH stabilnost | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 h) Slika 3 |
| Termička stabilnost | Ispod 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Slika 4 |
| Stabilnost skladištenja | Preko 90% aktivnosti tokom 12 meseci na 25 ℃ |
| Aktivatori | SDS, urea |
| Inhibitori | Diizopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorid |
Prijave
1. Genetski dijagnostički komplet
2. Kompleti za ekstrakciju RNK i DNK
3. Ekstrakcija neproteinskih komponenti iz tkiva, razgradnja proteinskih nečistoća, kao što je DNKvakcine i priprema heparina
4. Priprema hromozomske DNK pulsnom elektroforezom
5. Western blot
6. Enzimski glikozilovani albuminski reagensi in vitro dijagnostika
Mjere predostrožnosti
Nosite zaštitne rukavice i zaštitne naočale kada koristite ili vagate, a nakon upotrebe održavajte ga dobro prozračenim.Ovaj proizvod može izazvati alergijsku reakciju kože i ozbiljnu iritaciju očiju.Ako se udiše, može izazvati alergiju ili simptome astme ili dispneju.Može izazvati iritaciju disajnih puteva.
Definicija jedinice
Jedna jedinica (U) je definirana kao količina enzima potrebna za hidrolizu kazeina za proizvodnju 1 μmoltirozina u minuti pod sledećim uslovima.
Priprema reagensa
Reagens I: 1 g mlečnog kazeina je rastvoren u 50 ml 0,1 M rastvora natrijum fosfata (pH 8,0), inkubiran u vodi na 65-70 ℃ 15 minuta, mešan i rastvoren, ohlađen vodom, podešen natrijum hidroksidom i fiksiran pH na 8,0, pH vrednost je 8,0. 100ml.
Reagens II: 0,1 M trihlorosirćetna kiselina, 0,2 M natrijum acetat, 0,3 M sirćetna kiselina.
Reagens III: 0,4M Na2CO3rješenje.
Reagens IV: Forint reagens razrijeđen čistom vodom 5 puta.
Reagens V: Enzimski razblaživač: 0,1 M rastvor natrijum fosfata (pH 8,0).
Reagens VI: rastvor tirozina: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirozina otopljenog sa 0,2M HCl.
Procedura
1. 0,5 ml reagensa I prethodno se zagreje na 37 ℃, doda se 0,5 ml rastvora enzima, dobro promeša i inkubira na37℃ tokom 10 minuta.
2. Dodajte 1 ml reagensa II da zaustavite reakciju, dobro promiješajte i nastavite inkubaciju 30 minuta.
3. Centrifugirajte reakcijsku otopinu.
4. Uzmite 0,5ml supernatanta, dodajte 2,5ml reagensa III, 0,5ml reagensa IV, dobro promiješajte i inkubirajte na 37℃za 30 min.
5. OD660je određen kao OD1;prazna kontrolna grupa: 0,5 ml reagensa V koristi se za zamjenu enzimarješenje za određivanje OD660kao OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Standardna krivulja L-tirozina: 0,5 mL različite koncentracije otopine L-tirozina, 2,5 mL reagensa III, 0,5 mL reagensa IV u epruveti za centrifugiranje od 5 mL, inkubirajte na 37 ℃ 30 minuta, otkrijte OD660za različite koncentracije L-tirozina, tada je dobijena standardna kriva Y=kX+b, gdje je Y koncentracija L-tirozina, X je OD600.
Kalkulacija
2: Ukupna zapremina reakcionog rastvora (mL)
0,5: Volumen rastvora enzima (mL)
0,5: Zapremina reakcione tečnosti koja se koristi u hromogenom određivanju (mL)
10: Vrijeme reakcije (min)
Df: Višestruko razrjeđivanje
C: Koncentracija enzima (mg/mL)
Reference
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,EUR.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, 2. izdanje, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Brojke
Fig.1 Optimum pH
100mM puferski rastvor:pH6,0-8,0, Na-fosfat;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, glicin-NaOH. Koncentracija enzima: 1mg/mL
Slika 2 Optimalna temperatura
Reakcija u 20 mM K-fosfatnom puferu pH 8,0.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 3 pH Stabilnost
25 ℃, 16 h-tretman sa 50 mM pufer rastvorom: pH 4,5-5,5, acetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, glicin-NaOH.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 4 Termički stabilnost
Tretman od 30 minuta sa 50 mM Tris-HCl puferom, pH 8,0.Koncentracija enzima: 1 mg/mL
Slika 5 Skladištenje stability at 25℃
