5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Kataloški broj: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) je visoko stabilna mješavina na bazi sonde u jednoj epruveti pogodna za reverznu transkripciju u jednom koraku i kvantitativni PCR (qRT-PCR).Podržava prethodno miješanje prajmera i sondi i ostaje stabilan nakon dugog skladištenja na niskoj temperaturi.Uzorak koji se testira može se dodati direktno prilikom upotrebe, bez dodatnog otvaranja cijevi/pipetiranja.Ovaj proizvod sadrži komponente, npr. DNK polimerazu sa vrućim startom, M-MLV, toplotno labilnu uracil DNK glikozilazu (TS-UNG), inhibitor RNaze, MgCl2, dNTP (sa dUTP umjesto dTTP) i stabilizatori.Uz genetski modificiranu brzu amplifikaciju reverzne transkriptaze i DNK polimeraze, moguće je završiti PCR amplifikaciju u roku od 20-40 minuta.Ovaj reagens koristi poseban pufer za qPCR sa pomiješanim enzimima enzima anti-inhibitorne amplifikacije i enzima UNG.Stoga, može postići dobro amplifikaciju ciljnih gena i spriječiti lažno amplifikaciju uzrokovanu PCR rezidualnim i aerosolnim zagađenjem.Ovaj reagens je kompatibilan sa većinom fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumenata proizvođača kao što su Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad i Roche.
Komponenta
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG miks
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Uslovi skladištenja
Sve komponente treba čuvati na -20 ℃ za dugotrajno skladištenje i 4 ℃ do 3 meseca.Molimo Vas da dobro promiješajte nakon odmrzavanja i centrifugirajte prije upotrebe.Izbjegavajte često zamrzavanje-odmrzavanje.
qRT-PCR Reaction System Priprema
| Komponente | 25μLSistem | 50μLSistem | Konačna koncentracija |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG miks | 1μL | 2μL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mixa | 1μL | 2μL | 1× |
| Template RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Do 25μL | Do 50μL | – |
1) a. Konačna koncentracija prajmera je obično 0,2 μM.Za bolje rezultate, koncentracija prajmera može se optimizirati u rasponu od 0,2-1 μM.Generalno, koncentracija sonde se može optimizirati u rasponu od 0,1-0,3 μM.
2) b. Kada se koristi brza PCR procedura, povećanje koncentracije prajmera i sondi može rezultirati boljim rezultatima amplifikacije, te njihov odnos treba optimizirati u skladu s tim.
3) Različiti tipovi uzoraka sadrže različite vrste i sadržaj inhibitora i broj kopija ciljnog gena.Volumen uzorka treba uzeti u obzir prema stvarnom stanju.Razblažite uzorak vodom bez nukleaza ili TE puferom, ako je potrebno.
Reakcija Cuslovi
| Redovna PCR procedura | Brza PCR procedura | ||||||
| Procedura | Temp. | Vrijeme | Ciklus | Procedura | Temp. | Vrijeme | Ciklus |
| Reverzna transkripcija | 50℃ | 10-20min | 1 | Reverzna transkripcija | 50℃ | 5mins | 1 |
| Polimeraza Aktivacija | 95℃ | 1-5mins | 1 | Polimeraza Aktivacija | 95℃ | 30s | 1 |
| Denaturacija | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturacija | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Žarenje i Produžetak | 56-64℃ | 20-60s | Žarenje i Produžetak | 56-64℃ | 3-20s | ||
Kontrola kvaliteta
1.Detekcija funkcije: osjetljivost, specifičnost i ponovljivost qPCR-a.
2.Nema aktivnosti egzogene nukleaze: nema zagađenja egzogenom endonukleazom i egzonukleazom.
Bilješke
1.Brzina amplifikacije brze DNK polimeraze nije manja od 1kb/10s.Različiti PCR instrumenti imaju različite brzine grijanja i hlađenja, načine kontrole temperature i toplinsku provodljivost, pa je stoga optimizacija koncentracije prajmera/sonde i metode rada u kombinaciji sa vašim specifičnim brzim PCR instrumentom od suštinskog značaja.
2.Ovaj proizvod ima široku primjenu i pogodan je za visokoosjetljivu molekularnu dijagnostiku.Metoda PCR u tri koraka se preporučuje za prajmere sa niskom temperaturom žarenja ili za amplifikaciju dugih fragmenata preko 200 bp.
3.Budući da različiti amplikoni imaju različitu efikasnost korištenja dUTP-a i različitu osjetljivost na UNG, reagense bi trebalo optimizirati ako se osjetljivost detekcije smanjuje kada se koristi UNG sistem.Molimo kontaktirajte nas za tehničku podršku ako je potrebno.
4.Da bi se izbjegla amplifikacija PCR proizvoda koji se prenose, potrebna je posebna eksperimentalna površina i pipeta za amplifikaciju.Radite u rukavicama i često se mijenjajte i ne otvarajte PCR epruvetu nakon amplifikacije.
