2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Kataloški broj: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) je dizajniran da izvodi PCR direktno iz uzoraka bez ekstrakcije DNK ili pripreme uzorka.Ovaj reagens se sastoji od DNK polimeraze vrućeg starta, uracil DNK glikozilaze (UNG), inhibitora RNAze, MgCl2, dNTP (sa dUTP umjesto dTTP) i stabilizatori, za kvantitativni PCR (qPCR).Ovaj reagens ima visoku otpornost na inhibitore i stoga se može direktno primijeniti na detekciju uzoraka kao što su bris grla, pljuvačka, antikoagulirana puna krv, plazma i serum bez ekstrakcije DNK.Reagens koristi vlasnički pufer za qPCR s miješanim enzimima anti-inhibitorne DNK polimeraze i UNG enzima.Stoga, može postići dobro pojačanje ciljnih gena u uzorcima koji sadrže inhibitore i inhibirati lažno pozitivnu amplifikaciju uzrokovanu PCR rezidualnim i aerosolnim zagađenjem.Ovaj reagens je kompatibilan sa većinom fluorescentnih kvantitativnih PCR instrumenata, kao što su Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche i tako dalje.
Komponente
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix pufer (dUTP)
Uslovi skladištenja
Sve komponente treba čuvati na -20 ℃ za dugotrajno skladištenje i 4 ℃ do 3 meseca.Molimo Vas da dobro promiješajte nakon odmrzavanja i centrifugirajte prije upotrebe.Izbjegavajte često zamrzavanje-odmrzavanje.
Cycling Protocol
| Korak | Temperatura | Vrijeme | Ciklus |
| Varenje | 50℃ | 2min | 1 |
| Aktivacija polimeraze | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Denatura | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Žarenje/produženje | 56-64℃ | 20-60s |
Uputstva za pipetiranje
| Reagens | Volumen per reakcija | Volumen po reakciji | Konačna koncentracija |
| 2×SensiDirect Premix pufer (dUTP) | 12,5µL | 25µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Uzorak3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Ukupna zapremina | 25 μL | 50 μL | - |
1. Konačna koncentracija prajmera je obično 0,2 μM.Za bolje rezultate, koncentracija prajmera može se optimizirati u rasponu od 0,2-1 μM.
2. Generalno, koncentracija sonde se može optimizirati u rasponu od 0,1-0,3 μM.Optimalna koncentracija sonde je povezana sa instrumentom za PCR amplifikaciju u realnom vremenu, tipom sonde i tipom supstance za fluorescentno obeležavanje.Molimo pogledajte priručnik za instrumente ili specifične zahtjeve svake fluorescentne sonde.
3. Različiti tipovi uzoraka sadrže različite vrste i sadržaj inhibitora i broj kopija ciljnog gena.Volumen uzorka treba uzeti u obzir prema stvarnom stanju.Razblažite uzorak dodavanjem vode bez nukleaza ili TE pufera, ako je potrebno.
4. Preporučeni volumen različitih uzoraka:
| Uzorak | Volumen za jedan 50 μL reakcija | Maksimum odnos |
| Antikoagulirana puna krv | 2,5 μL | 5% |
| Plazma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Bris grla | 10 μL | 20% |
| Pljuvačka | 10 μL | 20% |
Kontrola kvaliteta
1. Detekcija funkcije: osjetljivost, specifičnost i ponovljivost qPCR-a.
2. Nema aktivnosti egzogene nukleaze: nema zagađenja egzogenom endonukleazom i egzonukleazom.
Napomene o proizvodu
1. Ovaj proizvod koristi novi tip DNK polimeraze sa vrućim startom, koja se može aktivirati za 1-5 minuta. Pošto je njegov reakcioni pufer optimizovan, pogodniji je za kvantitativni PCR sa dvostrukom ili višestrukom fluorescencijom pomoću metode sonde.
2. Ako je Rn vrijednost PCR amplifikacije preniska ili je amplifikacija očigledno inhibirana, smanjenje količine uzorka, povećanje volumena reakcije ili prethodno razrjeđivanje uzorka može poboljšati rezultate.
3. Prikupljanje krvi, pljuvačke, urina, brisa grla itd. treba da prati zahtjeve kliničkih kriterija, a svježi uzorak se može koristiti za sprječavanje razgradnje nukleinske kiseline.
4. Budući da različiti amplikoni imaju različitu efikasnost korištenja u odnosu na dUTP i osjetljivost na UNG, reagense treba optimizirati ako se osjetljivost detekcije smanji kada se koristi UNG sistem.Molimo kontaktirajte nas za tehničku podršku ako je potrebno.
5. Da bi se izbjegla amplifikacija PCR proizvoda koji se prenose između reakcija u jednom koraku, potrebna je posebna eksperimentalna površina i pipeta za amplifikaciju.Radite u rukavicama i često se mijenjajte i ne otvarajte reakcijsku epruvetu nakon PCR amplifikacije.
