M-MLV reverzna transkriptaza
RevScript Reverzna transkriptaza se dobija tehnologijom genetskog inženjeringa.Ima veću sposobnost sinteze cDNK, termičku stabilnost i ograničenje temperature reakcije (do 60°C).Sintetizirani cDNK proizvod je do 10 kb.Poboljšava afinitet šablona i pogodan je za reverznu transkripciju RNA šablona sa složenom sekundarnom strukturom ili genima sa niskim nivoom kopije.
Komponente
| Komponenta | HC2003B-01 (10.000U) | HC2003B-02 (5*10,000U) | HC2003B-03 (200.000U) |
| RevScript reverzna transkriptaza (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript bafer | 250 μL | 1,25 mL | 5 mL |
Stanje skladištenja
Ovaj proizvod treba čuvati na -25°C~-15°C 2 godine.
Definicija jedinice
Jedna jedinica uključuje 1 nmol dTTP-a u materijal nerastvorljiv u kiselini za 10 minuta na 37°C koristeći Oligo(dT) kao prajmer.
Reaction Setup
1. Denaturacija RNA šablona (Ovaj korak je neobavezan, denaturacija RNA šablona pomaže da se otvore sekundarne strukture, što će poboljšati prinos prvog lanca cDNK.)
| Komponente | Volumen (μL) |
| ddH bez RNaze2O | Do 13 |
| oligo(dT)18 (50 μmol/L) ili Random Primer (50 μmol/L) Ili genski specifični prajmeri (2 μmol/L) | 1 |
| ili 1 | |
| ili 1 | |
| RNA šablon | Xa |
napomene:
1) a: Ukupna RNK: 1-5 ug ili mRNA: 1-500 ng
2) Inkubirati na 65°C 5 minuta, a zatim odmah prebaciti na led da se ohladi 2 minute.Kratko centrifugiranje da se prikupi reakciona tečnost, dodajte reakcijski rastvor reverzne transkripcije kao što je prikazano u sledećoj tabeli.Pažljivo pipetirajte za miješanje.
1. Priprema reakcione smjese (20 μL zapremine)
| Komponente | Volumen (μL) |
| Mješavina prethodnog koraka | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP mješavina (10 nmol/L) | 1 |
| Reverzna transkriptaza (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNaze (40 U/μL) | 1 |
1.Izvedite reakciju pod sljedećim uvjetima:
| temperatura (°C) | Vrijeme |
| 25 °Ca | 5mins |
| 42 °Cb | 15-30min |
| 85 °Cc | 5mins |
napomene:
1) a.Inkubacija na 25°C u trajanju od 5 minuta potrebna je samo za korištenje nasumičnih heksamera.Molimo preskočite ovaj korak kada koristite Oligo (dT)18ili Gene Specific Primer.
2) b.Preporučena temperatura reverzne transkripcije je 42°C. Za šablone sa komplikovanom sekundarnom strukturom ili visokim sadržajem GC, preporučuje se podizanje temperature reakcije na 50-55°C.
3) c.Zagrijavanje na 85°C u trajanju od 5 minuta da se inaktivira reverzna transkriptaza.
4) Proizvod se može direktno koristiti u PCR ili qPCR reakcijama ili čuvati na -20°C za kratkotrajno skladištenje.Preporučljivo je uskladiti proizvode i čuvati na -80°C za dugotrajno skladištenje.Izbjegavajte često zamrzavanje-odmrzavanje.
5) Proizvod je pogodan za RT-qPCR u jednom koraku, preporučuje se dodavanje 10-20 U reverzne transkriptaze za svaki reakcioni sistem od 25 μL ili postepeno povećanje količine reverzne transkriptaze u skladu sa stvarnom situacijom.
Bilješke
1.Održavajte eksperimentalno područje čistim;Tokom rada treba nositi čiste rukavice i maske.Svi potrošni materijali korišteni u eksperimentu trebaju biti bez RNase kako bi se spriječila kontaminacija RNase.
2. Sve procedure treba izvoditi na ledu kako bi se spriječila degradacija RNK.
3. Preporučuju se visokokvalitetni RNA uzorci kako bi se osigurala visoka efikasnost reverzne transkripcije.
4.Ovaj proizvod je samo za istraživačku upotrebu.
5. Radi vaše sigurnosti koristite laboratorijske mantile i jednokratne rukavice.
