Mini komplet za ekstrakciju DNK
Ovaj komplet usvaja optimizirani sistem pufera i tehnologiju pročišćavanja kolone silika gela, koja može oporaviti fragmente DNK od 70 bp – 20 kb iz različitih koncentracija TAE ili TBE agaroznog gela.Kolona za adsorpciju DNK može posebno adsorpirati DNK pod visokim sadržajem soli.Osim toga, komplet može direktno prečistiti DNK fragmente iz PCR proizvoda, enzimskih reakcionih sistema ili sirovih DNK proizvoda dobijenih drugim metodama i ukloniti nečistoće kao što su proteini, druga organska jedinjenja, joni neorganske soli i oligonukleotidni prajmeri.Može osigurati da se pročišćavanje može završiti u roku od 10-15 minuta.Prečišćena DNK se može koristiti direktno za ligaciju, transformaciju, enzimsku digestiju, in vitro transkripciju, PCR, sekvenciranje, mikroinjekciju itd.
Uslovi skladištenja
Čuvati na -15 ~ -25 ℃ i transportovati na sobnoj temperaturi.
Komponente
| Komponente | (100 rxns) |
| Buffer GDP | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Pufer za eluiranje | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Buffer BDP:Pufer za vezivanje DNK.
Buffer GW:Pufer za pranje;prije upotrebe dodajte apsolutni etanol u količini naznačenoj na boci.
Pufer za eluiranje:Elucija.
FastPure DNA Mini Columns-G:DNK adsorpcione kolone.
Tube za sakupljanje 2 ml:Cijevi za sakupljanje filtrata.
Pripremljeni materijali
1,5 ml sterilizirane epruvete, apsolutni etanol i izopropanol (kada fragment DNK ≤100 bp, dodajte 1 volumen
izopropanola do 1 zapremine gela), vodeno kupatilo.
Proces eksperimentiranja
Dodajte 80 ml etanola da razrijedite pufer GW kako je naznačeno na etiketi prije upotrebe, čuvajte na sobnoj temperaturi.
Mehanizam
1. PCR reakcijski rastvor
Šema ekstrakcije gela: Dodajte jednaku zapreminu pufera GDP PCR reakcijske otopine Šema za oporavak:Dodajte 5 puta veći volumen pufera
2. BDP Izračunajte zapreminu gela (100 μl je 100 mg)
Otopiti gel
3. Zagrijati na 50 ~ 55℃
4. Bind Wash
Dodajte 300 μL Buffer GDP*
Dodajte 700 μL pufera GW
Dodajte 700 μL pufera GW
5. Elute
Dodajte 20 – 30 μL pufera za eluiranje ili dejonizirane vode
Napomene* Oporavak tečnosti PCR reakcije bez ovog koraka
Program ekstrakcije gela
1. Nakon DNK elektroforeze za frakcionisanje fragmenata DNK, izrežite jednu traku DNK fragmenta iz agaroznog gela pod UV svjetlom.Preporučljivo je koristiti upijajući papir kako bi apsorbirao prividnu vlagu gela i minimizirao veličinu kriške gela uklanjanjem viška agaroze koliko god je to moguće.Izvažite krišku gela (bez epruvete za mikrocentrifugu) da biste izračunali njenu zapreminu: Volumen 100 mg gel kriške je približno 100 μL, pod pretpostavkom da je gustina 1 g/ml.
2. Dodajte jednaku zapreminu pufera GDP, inkubirajte na 50~55℃ 7-10 min (prema veličini gela, podesite vrijeme inkubacije dok se gel potpuno ne otopi).Okrenite epruvetu 2 puta tokom inkubacije.
Δ Dodavanje 1-3 zapremine Buffer GDP-a neće uticati na efikasnost oporavka DNK.Ako fragment DNK koji se želi oporaviti <100 bp, potrebno je dodati 3 volumena Buffer GDP;kada se kriška gela potpuno otopi, dodajte 1 volumen izopropanola i dobro promiješajte, a zatim nastavite na sljedeći korak.
3. Centrifugirajte kratko da biste uzorak doveli na dno epruvete, umetnite FastPure DNA Mini Columns-G u epruvete za sakupljanje od 2 ml, pažljivo prenesite rastvor od maksimalno 700 μL jednom dnevno
vrijeme do filtracionih kolona, centrifugirajte na 12.000 o/min (13.800 X g) 30-60 sekundi.
4. Odbacite filtrat i dodajte 300 μL pufera GDP u kolonu, inkubirajte na sobnoj temperaturi 1 min, centrifugirajte na 12.000 rpm (13.800 X g) 30-60 sekundi.
5. Odbacite filtrat i dodajte 700 μL pufera GW (provjerite da li je apsolutni etanol dodat unaprijed!) u kolonu, centrifugirajte na 12.000 rpm (13.800 X g) 30-60 sekundi.
Δ Dodajte pufer GW oko stijenke adsorpcione kolone ili dodajte stražnji poklopac pufera GW i miješajte ga naopako 2 – 3 puta kako biste potpuno isprali sol koja je prianjala na zid cijevi.
6. Ponovite korak 5.
Δ Ispiranje puferom GW dva puta može osigurati da se sol potpuno ukloni i eliminira utjecaj na naredne eksperimente.
7. Odbacite filtrat i centrifugirajte praznu kolonu na 12.000 rpm (13.800 X g) 2 min.
8. Umetnite kolonu u čistu epruvetu za mikrocentrifugu od 1,5 ml, dodajte 20 - 30 μL pufera za eluiranje u centar membrane kolone, inkubirajte 2 min, a zatim centrifugirajte na 12.000 rpm (13.800 X g) 1 min.Bacite kolonu, sačuvajte dobijenu DNK na -20°C.
Δ Prenošenje supernatanta iz koraka 8 u kolonu da se ponovo eluira i predgrijavanje pufera za eluiranje na 55 (kada fragment DNK >3 kb) može pomoći da se poveća efikasnost oporavka.
Program za oporavak PCR proizvoda
Ovaj protokol je primjenjiv za prečišćavanje fragmenata DNK iz PCR proizvoda, enzimskog reakcionog sistema i drugih sirovih DNK proizvoda (uključujući genetsku DNK).Ovo rješenje može efikasno ukloniti različite nukleotide, prajmere, dimere prajmera, molekule soli, enzime i druge nečistoće.
1. Ukratko centrifugirajte PCR proizvode, rastvor enzimske reakcije i druge sirove DNK proizvode.Procijenite njihov volumen pipetom i prebacite u steriliziranu epruvetu od 1,5 ml ili 2 ml.Dodati ddH2O dok volumen ne dostigne 100 μL;dok će za genomsku DNK sa visokom koncentracijom, razblaživanje na 300 μL sa ddH2O pomoći da se poboljša efikasnost oporavka.
2. Dodajte 5 zapremina Buffer GDP-a, dobro promešajte invertovanjem ili vorteksiranjem.Ako je DNK fragment od interesa >100 bp, potrebno je dodati dodatnih 1,5 volumena (uzorci + puferski BDP) etanola.
3. Umetnite kolonu nazad u epruvetu za sakupljanje, prebacite mešavinu u kolonu, centrifugirajte na 12.000 o/min (13.800 × g) 30 – 60 sekundi.Ako je volumen pomiješane otopine >700 µL, vratite adsorpcionu kolonu u epruvetu za sakupljanje, prenesite preostali rastvor u adsorpcionu kolonu i centrifugirajte na 12.000 o/min (13.800 × g) 30 – 60 sekundi.
4. Sljedeća izvedba se odnosi na korak 5 – 8 programa 08-1/Gel ekstrakcije.
Prijave
Različite koncentracije TAE ili TBE agaroznog gela;PCR proizvodi, enzimski reakcioni sistemi ili drugi sirovi DNK proizvodi dobijeni različitim metodama.Pronađeni fragmenti variraju od70 bp -20 kb.
Bilješke
Samo za istraživačku upotrebu.Nije za upotrebu u dijagnostičkim procedurama.
1. Dodajte 80 ml etanola da razrijedite pufer GW kako je naznačeno na etiketi prije upotrebe, čuvajte na sobnoj temperaturi.
2. Ako se Buffer GDP lako taloži tokom skladištenja na niskoj temperaturi, može se staviti na sobnu temperaturu neko vrijeme prije upotrebe.Po potrebi se može prethodno zagrijati u vodenoj kupelji na 37℃ dok se talog potpuno ne otopi, a zatim se može koristiti nakon miješanja.
3. Podesite temperaturu vodenog kupatila na 50 ~55℃ unapred.
4. U 1. koraku programa ekstrakcije 08-1/gela, minimiziranje veličine kriške gela značajno će smanjiti vrijeme rastvaranja i povećati efikasnost oporavka (Linearizirana DNK se lako hidrolizira kada je kontinuirano izložena visokoj temperaturi).Ne izlažite DNK gel UV zračenju dugo vremena, jer ultraljubičasto svjetlo može uzrokovati oštećenje DNK.
5. U potpunosti rastvorite gel u koraku 2 programa ekstrakcije 08-1/Gel, inače će efikasnost oporavka DNK biti ozbiljno ugrožena.
6. Zagrijte pufer za eluiranje ili ddH2O na 55℃, što je korisno za poboljšanje efikasnosti eluiranja DNK.Preporučuje se čuvanje DNK u eluentu od 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 – 8,5.
