PNGase F
Peptid-N-glikozidaza F (PNGase F) je najefikasnija enzimska metoda za uklanjanje skoro svih N-vezanih oligosaharida iz glikoproteina.PNGaza F je amidaza, koja cijepa između većine unutrašnjih GlcNAc i asparaginskih ostataka oligosaharida s visokim udjelom manoze, hibrida i kompleksnih oligosaharida iz N-vezanih glikoproteina.
Aplikacija
Ovaj enzim je koristan za uklanjanje ostataka ugljikohidrata iz proteina.
Priprema i specifikacija
| Izgled | Bezbojna tečnost |
| Čistoća proteina | ≥95% (sa SDS-PAGE) |
| Aktivnost | ≥500.000 U/mL |
| Egzoglikozidaza | Nije bilo moguće otkriti nikakvu aktivnost (ND) |
| Endoglikozidaza F1 | ND |
| Endoglikozidaza F2 | ND |
| Endoglikozidaza F3 | ND |
| Endoglikozidaza H | ND |
| Proteaza | ND |
Svojstva
| EC broj | 3.5.1.52(rekombinantno iz mikroorganizama) |
| Molekularna težina | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrična tačka | 8. 14 |
| Optimalni pH | 7.0-8.0 |
| Optimalna temperatura | 65 °C |
| Specifičnost supstrata | Cepanje glikozidnih veza između GlcNAc i ostataka asparagina Slika 1 |
| Sajtovi za prepoznavanje | N-vezani glikani osim ako ne sadrže α1-3 fukozu Slika 2 |
| Aktivatori | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Temperatura skladištenja | -25 ~-15 ℃ |
| Inaktivacija toplote | Reakciona smjesa od 20 µL koja sadrži 1 µL PNGase F inaktivira se inkubacijom na 75 °C tokom 10 minuta. |
Slika 1 Specifičnost supstrata PNGase F
Slika 2 Sjedišta prepoznavanja PNGase F.
Kada su unutrašnji ostaci GlcNAc vezani za α1-3 fukozu, PNGase F ne može odcijepiti N-vezane oligosaharide iz glikoproteina.Ova modifikacija je uobičajena kod biljaka i nekih glikoproteina insekata.
Ckomponente
|
| Komponente | Koncentracija |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Pufer za denaturiranje glikoproteina | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definicija jedinice
Jedna jedinica(U) je definirana kao količina enzima potrebna za uklanjanje >95% ugljikohidrata iz 10 µg denaturirane RNKaze B za 1 sat na 37°C u ukupnoj reakcijskoj zapremini od 10 µL.
Uslovi reakcije
1.Rastvorite 1-20 µg glikoproteina sa dejonizovanom vodom, dodajte 1 µl 10×glikoproteinskog denaturirajućeg pufera i H2O (ako je potrebno) da dobijete ukupnu zapreminu reakcije od 10 µl.
2.Inkubirajte na 100°C 10 min, ohladite na ledu.
3.Dodajte 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 i promiješajte.
4.Dodajte 1-2 µl PNGase F i H2O (ako je potrebno) da se dobije ukupna zapremina reakcije od 20 µl i promešati.
5.Inkubirajte reakciju na 37°C 60 min.
6.Za SDS-PAGE analizu ili HPLC analizu.
