mRNA Cap2'-O-metiltransferaza
mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaza izvedena je iz rekombinantnog soja E. coli koji nosi gen za mRNA Cap 2 ´-O-metiltransferaze vakcinije.Ovaj enzim dodaje metilnu grupu na poziciji 2´-O prvog nukleotida pored strukture kapice na 5´kraju RNK. Enzim koristi S-adenozilmetionin (SAM) kao donatora metila za RNK sa kapom (cap -0) što rezultira strukturom cap-1.
Struktura Cap1 može povećati efikasnost translacije, poboljšavajući ekspresiju mRNA u eksperimentima transfekcije i mikroinjekcije. Ovaj enzim posebno zahtijeva RNK sa m7GpppN kapom kao supstratom.Ne može koristiti RNK sa pN, ppN, pppN ili GpppN na kraju 5´.Kapirana RNK se može pripremiti in vitro transkripcijom korištenjem cap analoga ili enzimskim zatvaranjem pomoću enzima za zatvaranje vakcine.
Komponente
mRNA Cap 2´-O-metiltransferaza (50U/μL)
10×Reakcioni pufer za zatvaranje
Skladištenje
-25 ～- 15 ℃ za skladištenje （ Izbjegavajte ponovljene cikluse zamrzavanja-odmrzavanja）
Međuspremnik za pohranu
20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glicerol.
Definicija jedinice
Jedna jedinica je definirana kao količina enzima potrebna za metiliranje 10 pmola 80 nt zatvorenog RNA transkripta u 1 satu na 37°C.
Testovi kontrole kvaliteta
Egzonukleaza:50U mRNA Cap 2´-O-metiltransferaze sa 1μg λ-Hind III digestira DNK na 37 ℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Endonukleaza: 50 U mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaze sa 1 μg λDNA na 37℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-metiltransferaze sa 1 μg pBR322 na 37 ℃ tokom 16 sati ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
RNase: 50U mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaze sa 1,6 μg MS2 RNK tokom 4 sata na 37℃ ne daje degradaciju kao što je utvrđeno elektroforezom u agaroznom gelu.
E. coli DNK: 50U mRNA Cap 2´ -O-metiltransferaze se testira na prisustvoE. coli genomska DNK koristeći TaqMan qPCR sa prajmerima specifičnim zaE. coli 16S rRNA lokus.TheE. coli kontaminacija genomskom DNK je =1E. coli genom.
Bakterijski Endotoksin: LAL-test, prema Kineskoj farmakopeji IV 2020 izdanje, metoda gela ograničenja, opće pravilo (1143).Sadržaj bakterijskog endotoksina bi trebao biti =10 EU/mg.
Reakcioni sistem i uslovi
1. Kombinujte odgovarajuću količinu zatvorene RNK i H2O bez RNaze u epruveti za mikrofuge od 1,5 mL do konačne zapremine od 16,0 µL.
2. Zagrevajte na 65℃ 5 minuta nakon čega sledi ledena kupka 5 minuta.
3. Dodajte sljedeće komponente navedenim redoslijedom (za metilaciju zatvorene RNK
manje od 10
| Komponenta | Volume |
| Denaturirana kapirana RNA | 16 μL |
| 10X Reakcioni pufer za zatvaranje* | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA Cap 2´-O-metiltransferaza (50 U/μL) | 1 μL |
| ddH2O | Do 20 μL |
*10× Reakcioni pufer za zatvaranje: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. Inkubirajte na 37℃ 1 sat (2 sata inkubacije se preporučuje za ciljni fragment manji od 200 nt).
Prijave
Za poboljšanje ekspresije mRNA tokom eksperimenata mikroinjekcije i transfekcije.
Napomene o upotrebi
1. Prije reakcije, RNK treba pročistiti i otopiti u vodi bez nukleaza, svi rastvori ne bi trebali sadržavati EDTA i jone.
2. Preporučuje se zagrijavanje uzorka RNK na 65℃ 5 minuta prije reakcije kako bi se uklonila sekundarna struktura na 5´kraju transkripta.Može se produžiti na 10 min za složenu strukturu 5 ´ terminala.
