Dvolančana RNA (dsRNA) ELISA KIT

Ovaj komplet je enzimski imunosorbentni test (ELISA) koji se spaja sa sistemom biotin-streptavidin, za kvantitativno mjerenje dsRNA dužine iznad 60 parova baza (bp), bez obzira na sekvencu.Ploča je prethodno obložena anti-dsRNA antitelom.dsRNA prisutna u uzorku se dodaje i vezuje za antitijela obložena na jamicama.Zatim se dodaje biotinilirano anti-dsRNA antitijelo i vezuje se za dsRNA u uzorku.Nakon ispiranja, dodaje se HRP-streptavidin i vezuje se za biotinilirano anti-dsRNA antitijelo.Nakon inkubacije nevezani HRP-streptavidin se ispere.Zatim se dodaje otopina TMB supstrata i katalizira HRP kako bi se dobio proizvod plave boje koji se promijenio u žutu nakon dodavanja kiselog stop otopine.Gustina žute je proporcionalna ciljnoj količini dsRNA uhvaćene u ploči.Apsorbancija se mjeri na 450 nm.

Aplikacija

Ovaj komplet je za kvantitativno mjerenje rezidualne dsRNA.

Komponente kompleta

Skladištenje i stabilnost

1. Za nekorišteni komplet: Cijeli komplet se može čuvati na 2~8℃ tokom roka trajanja.Jaku svjetlost treba izbjegavati radi stabilnosti skladištenja.

2. Za korišteni komplet: Kada se mikroploča otvori, pokrijte neiskorištene jažice zaptivačem za ploče i vratite se u vrećicu od folije u kojoj se nalazi pakovanje sredstva za sušenje, zatvorite vrećicu sa rajsferšlusom i vratite se na 2~8℃ što je prije moguće nakon upotrebe.Ostale reagense treba vratiti na 2~8℃ što je prije moguće nakon upotrebe.

Potrebni materijali, ali nisu isporučeni

1. Čitač mikroploča sa filterom od 450±10 nm (bolje ako može detektovati na talasnoj dužini od 450 i 650 nm).

2. Šejker za mikroploče.

3. Vrhovi i epruvete za centrifugiranje bez RNaze.

Dijagram toka operacije

Prije nego što počnes

1. Sve komponente i uzorke kompleta dovedite na sobnu temperaturu (18-25℃) prije upotrebe.Ako se komplet neće potrošiti odjednom, izvadite samo trake i reagense za sadašnji eksperiment, a preostale trake i reagense ostavite u potrebnom stanju.

2. Pufer za pranje: razrijedite 40 mL 20× koncentrovanog pufera za pranje sa 760 mL dejonizirane ili destilovane vode da biste pripremili 800 mL 1× pufera za pranje.

3. Standard: kratko centrifugirajte ili centrifugirajte osnovni rastvor prije upotrebe.Koncentracija četiri ponuđena standarda je 5ng/μL.Za standarde UTP i pUTP dsRNA, razrijedite osnovni rastvor na 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivu.Za standarde N1-Me-pUTP dsRNA, razrijedite osnovni rastvor na 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivu.Za standard 5-OMe-UTP dsRNA, razrijedite osnovni rastvor na 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL sa STE puferom da nacrtate standardnu ​​krivu.Preporučujemo da se standardi mogu razrijediti kao sljedeće grafikone:

4. Biotinilirano detekciono antitelo i radni rastvor HRP-streptavidina: kratko centrifugirajte ili centrifugirajte osnovni rastvor pre upotrebe.Razrijedite ih do radne koncentracije puferom za razrjeđivanje.

5. TMB podstanje: aspirirajte potrebnu dozu rastvora sa sterilizovanim vrhovima i nemojte ponovo bacati preostali rastvor u bočicu.TMB supstrat je osetljiv na svetlost, ne izlažite TMB podlogu svetlu duže vreme.

Koristeći protokol

1. Odredite broj traka potrebnih za analizu.Umetnite trake u okvire za upotrebu.Preostale trake ploča koje se ne koriste u ovom testu treba ponovo upakovati u vrećicu sa sredstvom za sušenje.Čvrsto zatvorite vrećicu za skladištenje u hladnjaku.

2. Dodajte po 100 μL razblaženja standarda, slijepe probe i uzoraka u odgovarajuće jažice.Pokrijte zaptivačem ploča.Inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje na 500 o/min.Uzorke treba razrijediti STE puferom do odgovarajuće koncentracije za tačan test.

3. Korak ispiranja: Aspirirajte rastvor i isperite sa 250 μL pufera za ispiranje u svaku jažicu i ostavite da odstoji 30 sekundi.U potpunosti bacite pufer za pranje tako što ćete ploču zalijepiti na upijajući papir.Potpuno oprati 4 puta.

4. Dodajte 100 μL radnog rastvora biotinilovanog detekcionog antitela u svaku jažicu.Pokrijte zaptivačem ploča.Inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi uz mućkanje na 500 o/min.

5. Ponovite korak pranja.

6. Dodajte 100 μL radne otopine HRP-streptavidina u svaku jažicu.Pokrijte zaptivačem ploča.Inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi uz mućkanje na 500 o/min.

7. Ponovite korak pranja ponovo.

8. Dodajte 100 μL rastvora TMB supstrata u svaku jažicu.Pokrijte zaptivačem ploča.Inkubirajte 30 min na sobnoj temperaturi Zaštitite od svjetlosti.Tečnost će postati plava dodavanjem rastvora supstrata.

9. Dodajte 50 μL stop rastvora u svaku jažicu.Tečnost će postati žuta dodatkom stop rastvora.Zatim pokrenite čitač mikroploča i odmah obavite mjerenje na 450 nm.

Obračun rezultata

1. Prosječite duplirana očitanja za svaki standard, kontrolu i uzorak i oduzmite prosječnu nultu standardnu ​​optičku gustoću.Konstruirajte standardnu ​​krivu s apsorbancijom na vertikalnoj (Y) osi i koncentracijom dsRNA na horizontalnoj (X）osi.

2. Preporučuje se da se proračun izvrši pomoću kompjuterskog softvera za prilagođavanje krive, kao što je curve expert 1.3 ili ELISA Calc u modelu nelinearnog uklapanja sa 5 ili 4 parametra.

Performanse

1. Osjetljivost:

donja granica detekcije: ≤ 0,001 pg/μL (za UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (za 5-OMe-UTP-dsRNA).

donja granica kvantifikacije: 0,0156 pg/μL (za UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (za N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (za 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Preciznost: CV intra-testa ≤10%, CV inter-test ≤10%

3. Oporavak: 80%~120%

4.Linearnost:0,0156-0,5pg/μL(zaUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(zaN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(za 5-OMe-UTP-dsRNA).

Razmatranja

1. Temperatura i vrijeme reakcije TMB su kritični, molimo vas da ih strogo kontrolirajte prema uputama.

2. Da bi se postigla dobra ponovljivost i osjetljivost analize, neophodno je pravilno pranje ploča kako bi se uklonio višak nereagiranih reagensa.

3. Sve reagense treba dobro promešati pre upotrebe i izbegavati bubble tokom dodavanja uzorka ili reagensa.

4. Ako su se kristali formirali u koncentrovanom puferu za pranje (20x), zagrijte na 37℃ i lagano miješajte dok se kristali potpuno ne otope.

5. Izbjegavajte analizu uzoraka koji sadrže natrijum azid (NaN3), jer bi to moglo uništiti aktivnost HRP-a što rezultira podcjenjivanjem količine dsRNA.

6. Izbjegavajte kontaminaciju RNase tokom analize.

7. Standard/uzorak, detekciono antitelo i SA-HRP se takođe mogu sprovesti na sobnoj temperaturi bez mućkanja, ali to može dovesti do smanjenja osetljivosti detekcije za jednostruko.Za ovaj slučaj preporučujemo da se standardi UTP i pUTP dsRNA razrijede od 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA standardi trebaju biti razrijeđeni sa 4pg/μL i 5-OMe-UTP dsRNA standardi se razrijede sa 8pg/μL.Osim toga, inkubirajte radnu otopinu HRP-streptavidina 60 minuta na sobnoj temperaturi.Nemojte koristiti šejker za tikvicu, jer on može dovesti do netačnog rezultata.

Tipičan rezultat

1. Podaci standardne krive

2. Proračun standardne krive

3. Opseg detekcije obloge: 0,0312-1 pg/μL